黔江煙區(qū)煙草青枯病生防細菌的篩選鑒定及其抑菌活性產(chǎn)物的研究.pdf

1、本試驗以煙草青枯病病原菌為防治對象，對從黔江健康煙區(qū)煙草根際土壤中分離出的87株細菌進行直接對峙篩選初步篩選，獲得2株對煙草青枯病菌有較好拮抗性的細菌5D15和5B18，通過全細胞脂肪酸分析和16SrDNA分析，鑒定了兩株細菌的種屬；然后優(yōu)化了兩株生防細菌的培養(yǎng)基組成，制備了2株細菌的發(fā)酵產(chǎn)物，通過濾紙片法對粗提物再次篩選，確定了2株細菌的發(fā)酵產(chǎn)物都能夠抑制煙草青枯病病原菌；最后用薄層層析法確定了發(fā)酵產(chǎn)物的柱分離條件，對2株菌的發(fā)酵產(chǎn)物

2、進行硅膠柱分離，通過核磁共振波譜法、質(zhì)譜法和紅外光譜法鑒定了活性物質(zhì)的化學組成，為煙草青枯病生物防治的研究提供了參考。主要結論如下：
　　 (1)采用系列稀釋法和平板涂布法，從黔江健康煙區(qū)土樣中分離出87株細菌。直接對峙試驗結果表明，細菌5D15和5B18對煙草青枯病病原菌有較好的拮抗作用，拮抗半徑分別達到8.4mm和10.2mm。對兩株細菌進行發(fā)酵，制備其發(fā)酵產(chǎn)物，配成25mg/mL的粗提物溶液，進行濾紙片法抑菌試驗，結果顯示

3、，菌株5D15和5B18提取物的抑菌半徑分別為6.2mm和8.0mm。
　　 (2)對5D15和5B18進行全細胞脂肪酸分析和16SrDNA分析，結果表明，5D15與銅綠假單孢菌親緣關系最近，達到99.6％，5B18與芽孢桿菌親緣關系最近，達到99.4％。
　　 (3)通過正交試驗，優(yōu)化了生防細菌5D15和5B18的培養(yǎng)基條件。對5D15的培養(yǎng)基設計了四因素五水平正交試驗，發(fā)現(xiàn)氯化鈉的濃度對5D15的生長影響最為顯著，當

4、氯化鈉濃度為10.0g/mL時，5D15的生長情況最好。對5B18，首先比較了牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的影響，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基更適合5B18的生長，設計了三因素四水平正交試驗，考察了馬鈴薯、葡萄糖和pH三種因素對5B18的影響。結果表明，馬鈴薯的濃度對5B18的生長速度影響最為顯著，當馬鈴薯濃度為350g/L時，5B18生長條件最好。
　　 (4)將5D15的發(fā)酵產(chǎn)物初步分成極性不同的三部分：正己烷相、二氯甲

5、烷相和甲醇相，濾紙片法活性測試結果顯示，活性組分集中于二氯甲烷相。采用薄層層析法選擇分離5D15活性產(chǎn)物的溶劑體系和溶劑比例，結果表明，二氯甲烷和甲醇體系適于5D15活性產(chǎn)物的分離，分離條件為甲醇含量分別為2％、4％、6％、10％和20％的梯度洗脫。對柱分離產(chǎn)物進行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)16～25號流出物對煙草青枯病病原菌有抑制活性，然后采用結晶法進一步純化活性產(chǎn)物，高效液相色譜面積歸一化法結果顯示，活性產(chǎn)物含量為76.11％。采用MIC法測得

6、純化產(chǎn)物對煙草青枯病的半抑制濃度介于40～160μg/mL之間。核磁共振波譜分析和紅外光譜分析結果表明，活性成分主要為環(huán)二肽-(酪氨酸-亮氨酸)。
　　 (5)將5B18的發(fā)酵產(chǎn)物初步分成極性不同的三部分：正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相，濾紙片法活性測試結果顯示，活性組分集中于二氯甲烷相和甲醇水相。采用薄層層析法選擇分離5B18活性產(chǎn)物的溶劑體系和溶劑比例，結果表明，二氯甲烷和甲醇體系適于5D15二氯甲烷相的分離，分離條件為甲醇含