ES小鼠的制備及SP-了mRNA的表達(dá)分析.pdf

1、ES小鼠屬于克隆小鼠,是研究人類疾病的最佳模式動物。利用四倍體胚胎補償技術(shù)可以得到完全由ES細(xì)胞發(fā)育而來的小鼠,即ES小鼠。盡管四倍體胚胎補償技術(shù)獲得了大家的公認(rèn),但采用這一技術(shù)制備ES小鼠的效率較低,其影響因素很多。如四倍體胚胎的制作方法和遺傳背景、體外培養(yǎng)環(huán)境、ES細(xì)胞的傳代次數(shù)等都是影響獲得:ES小鼠的重要因素。四倍體胚胎發(fā)育階段也是其中的一個重要因素,關(guān)于四倍體胚胎發(fā)育階段對ES小鼠制備的研究目前還沒有。
　　 新生有活

2、力的ES小鼠(有短暫的呼吸現(xiàn)象)并非都能發(fā)育至成年,有相當(dāng)一部分在出生后立刻表現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難和青紫呼吸衰竭征象,其壽命不會超過l小時,肺部病理表現(xiàn)為肺泡壁增厚和肺泡擴張不全,而且,這種呼吸衰竭征是導(dǎo)致新生ES小鼠死亡的主要疾病。死于呼吸衰竭的新生ES小鼠幾乎沒有SP-B蛋白的表達(dá),即使那些外觀正常的成年ES小鼠的SP-B蛋白表達(dá)水平也很低。因此SP-B基因很可能是一個確保新生克隆動物存活至成年的關(guān)鍵基因。
　　 通過2-細(xì)胞胚

3、胎電融合法制備四倍體胚胎,采用顯微注射方法將ES細(xì)胞分別注入1-細(xì)胞、4-細(xì)胞、囊胚三個發(fā)育階段的四倍體胚胎中。所用ES細(xì)胞分別為雜交系B6D2F1×129／Sv和近交系C578L／6J,經(jīng)胚胎移植和剖腹產(chǎn)獲得ES小鼠。結(jié)果顯示,雜交ES細(xì)胞注射四倍體囊胚獲得40只ES小鼠,效率顯著高于近交系ES細(xì)胞以及其他發(fā)育階段的四倍體胚胎,ES小鼠與B6D2F1×129／Sv雜交小鼠毛色一致且具有正常生殖能力。實驗中,我們還研究了E型鈣粘連蛋白抗

4、體(ECCD-1)對胚胎體外發(fā)育的影響,并利用ECCD-1處理8細(xì)胞胚胎注射ES細(xì)胞方法產(chǎn)生嵌合體。結(jié)果表明,ECCD-1阻止了胚胎分裂球間的連接,推遲致密化過程,但不影響囊胚ICM的形成。ECCD-1培養(yǎng)8-細(xì)胞胚胎注射ES細(xì)胞也能獲得完全由ES細(xì)胞發(fā)育而來的小鼠。
　　 分別取14只死于呼吸衰竭的新生ES小鼠和14只新生正常小鼠(相同遺傳背景)的肺組織,提取RNA。用半定量PCR方法檢測SP-B mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果表明