肺炎支原體感染小鼠Th1-Th2細(xì)胞平衡狀況及Tim-3 mRNA表達(dá)的分析.pdf

1、目的：肺炎支原體(Mycoplasma Pneumoniae，Mp)是能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物。是引起小兒下呼吸道感染的主要致病菌之一。肺炎支原體感染在世界各地均有發(fā)生，近年來(lái)，Mp感染發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Mp全球感染率達(dá)9.6％-66.7％不等，已被認(rèn)為是社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的第三位病原體。Mp除引起非典型性肺炎之外，還可引起嚴(yán)重的肺外并發(fā)癥，如腦膜腦炎、心肌炎、免疫性溶血性貧血及腎炎等，尤其在

2、免疫低下人群中可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，因此對(duì)其致病機(jī)制的研究日益受到人們的關(guān)注，Mp感染的致病機(jī)制主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制等學(xué)說(shuō)，目前大多傾向于免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，多數(shù)研究認(rèn)為MP感染可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，導(dǎo)致T細(xì)胞亞群失衡、T細(xì)胞功能低下，Th1型細(xì)胞受到抑制，但Mp感染后機(jī)體免疫的動(dòng)態(tài)變化及其免疫調(diào)控作用目前尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白（T-cell immunoglobulin and m

3、ucin，Tim）是新近發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于T細(xì)胞表面的跨膜蛋白家族。Tim-3主要表達(dá)于分化成熟的Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞無(wú)表達(dá)。Tim-3與廣泛表達(dá)在人、小鼠脾臟和淋巴組織中的配體半乳凝素-9(galectin-9)結(jié)合，組成Tim-3/galectin-9通路，通過(guò)該途徑抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)外周免疫耐受，是Th1免疫反應(yīng)的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因素;Mp感染后是否會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2失衡，這種失衡是否與Tim-3/galectin-9通

4、路有關(guān)？目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 為了探討Mp感染后機(jī)體的免疫狀態(tài)以及Tim-3在Mp感染中的作用，本實(shí)驗(yàn)建立了Mp感染動(dòng)物模型，并對(duì)Tim-3及一些相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)，為Mp感染后機(jī)體的免疫變化及其機(jī)制的分析提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、肺炎支原體FH株培養(yǎng)將復(fù)蘇的Mp FH株接種于PPLO液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基中指示劑的變化及菌落形態(tài)判定Mp生長(zhǎng)狀態(tài)。支原體濃度測(cè)定應(yīng)用顏色改

5、變單位CCU/L確定濃度。
　　 二、動(dòng)物分組
　　 SPF級(jí)Balb/c小鼠60只，分成2組，設(shè)3、5、7、14、21天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組每只鼠滴鼻接種濃度為108ccu/ml Mp菌液0.02ml，對(duì)照組接種PBS緩沖液。
　　 正常對(duì)照組:用PBS做對(duì)照每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只共25只Mp感染組:用Mp感染小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7只共35只三、感染動(dòng)物動(dòng)物麻醉后實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)鼻腔滴鼻感染肺炎支原體，對(duì)照組小鼠用PBS滴鼻;正常

6、飲食飲水飼養(yǎng)，并觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。
　　 四、體重變化和肺指數(shù)小鼠感染肺炎支原體后，每天準(zhǔn)確稱量小鼠體重，觀察其體重變化情況并記錄;無(wú)菌解剖取小鼠全肺稱重，并計(jì)算肺指數(shù)。
　　 五、小鼠肺組織病理變化分別于感染3d、5d、7d、14d、21d后無(wú)菌解剖取小鼠全肺，觀察肺組織表面變化，取部分肺組織及氣管于10％福爾馬林固定后石蠟包埋、切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　 六、PCR法檢測(cè)肺泡灌洗液支

7、原體DNA取小鼠右側(cè)肺，按常規(guī)方法制作肺泡灌洗液，部分灌洗液用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA，PCR法擴(kuò)增支原體DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有肺炎支原體DNA;其余部分灌洗液用4℃離心機(jī)于1000r/min，離心20min，取上清做好標(biāo)記，-20℃保存，用于細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　 七、細(xì)胞因子水平測(cè)定ELISA試劑盒測(cè)定感染后細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)OD450值，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg

8、/ml)。
　　 八、Tim-3 mRNA表達(dá)水平測(cè)定分別于感染3d、5d、7d、14d、21d后無(wú)菌解剖取小鼠全肺及脾臟，稱重后提取左側(cè)肺組織和脾臟的mRNA，用RT-PCR方法測(cè)定Tim-3 mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 一、一般情況及肺指數(shù)
　　 （一）感染肺炎支原體后小鼠一般情況及體重變化接種Mp FH株的35只小鼠全部存活，感染組小鼠較對(duì)照組體溫降低，食欲欠佳，精神狀態(tài)差;感染后體重增

9、長(zhǎng)緩慢。
　　 （二）肺指數(shù)
　　 肺指數(shù)值升高，表示肺重量增加，肺部炎性病變程度嚴(yán)重;感染肺炎支原體后小鼠的肺指數(shù)明顯升高，其中感染后第3d和5d升高明顯，分別為2.12％和2.53％，隨著病程的延長(zhǎng)肺指數(shù)逐漸下降。
　　 二、肺組織病理變化解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染組肺組織表面有充血和程度不同的散在出血點(diǎn)，鏡檢為急性細(xì)支氣管炎伴有間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔增寬，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在肺泡間隔及支氣管和血管周圍;對(duì)照組動(dòng)

10、物肺表面外觀正常，鏡檢末見(jiàn)明顯異常。
　　 三、PCR法檢測(cè)肺泡灌洗液支原體DNA提取小鼠肺泡灌洗液DNA，PCR擴(kuò)增支原體DNA，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)感染組小鼠在894bp處有一清晰條帶即肺炎支原體DNA呈陽(yáng)性，對(duì)照組為陰性。
　　 四、Elisa試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子含量感染肺炎支原體后，實(shí)驗(yàn)組小鼠IFN-γ于3d出現(xiàn)升高(p＜0.05)，5d開(kāi)始受到一定程度的抑制;IL-4從3d開(kāi)始升高，7d達(dá)到高峰(P＜0.05)，之

11、后緩慢下降。
　　 五、RT-PCR法測(cè)定Tim-3 mRNA表達(dá)水平肺炎支原體感染后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織、脾臟Tim-3 mRNA表達(dá)水平均于3d出現(xiàn)升高，5d達(dá)到高峰，脾臟Tim-3 mRNA表達(dá)水平于7d開(kāi)始下降而肺組織則持續(xù)升高至7d。
　　 結(jié)論：
　　 1、小鼠感染肺炎支原體后IFN-γ和IL-4均于第3天出現(xiàn)升高，但從第5天開(kāi)始IFN-γ受到了一定程度的抑制而IL-4則持續(xù)升高，提示肺炎支原體感染后存