血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)在糖尿病大鼠腎損傷中的作用及其機(jī)制.pdf

1、本文對ACE2在糖尿病大鼠腎臟損傷過程中的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步探討。研究包括以下三個部分:
　　 1試驗性糖尿病大鼠腎損傷模型的建立
　　 目的：建立試驗性糖尿病大鼠腎損傷模型,觀察高血糖致腎臟損傷不同時間點的病理生理特點和變化趨勢,并對腎臟損傷病變程度加以鑒定,為后期研究提供可靠的試驗動物模型。
　　 方法：健康成年SD大鼠40只,隨機(jī)取16只作為正常對照組,按0.1mL/kg體重劑量腹腔注射檸檬酸緩沖液。其余

2、大鼠按60mg/kg體重劑量一次性腹腔注射STZ,注射藥物24h、72h后血糖儀測所有大鼠的空腹血糖,2次測定血糖值均高于11.1mmol/L為糖尿病大鼠。試驗觀察期30天,期間每天記錄大鼠體重、攝食量和飲水量并觀察各組大鼠神態(tài)、毛色以及活動狀況等變化。分別于15天(模型組1)和30天(模型組2),隨機(jī)選取8只模型組大鼠和8只正常對照組大鼠斷頭處死,取血清、尿液及腎臟組織,測定所有大鼠血糖、尿糖、尿素氮、尿肌酐、尿蛋白含量；觀察腎臟病理

3、組織學(xué)變化.
　　 結(jié)果：(1)注射STZ48-72h后大鼠開始出現(xiàn)多尿、多飲癥狀,并伴有活動減少；(2)正常對照組大鼠血糖值介于4.9-6.5mmol/L之間；模型組1(15天)大鼠血糖值均在14.0-17.5mmol/L之間；模型組2(30天)大鼠血糖值均高于24mmol/L；(3)模型組1大鼠尿糖升高,與正常對照組相比差異顯著(P<0.05),尿蛋白,尿肌酐和尿素氮含量均高于正常對照組(P>0.05)；而模型組2大鼠的尿糖

4、、尿蛋白、尿肌酐和尿素氮含量均顯著高于正常對照組(P<0.01)；(4)病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示:正常對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常；模型組1大鼠腎小球基底膜呈不規(guī)則增厚,腎小管結(jié)構(gòu)基本正常.模型組2大鼠腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬,腎組織損傷嚴(yán)重。(5)不同時間點亞組間比較發(fā)現(xiàn):正常對照組間大鼠體重隨時間延長逐漸增加,血糖、尿量、尿蛋白排出量、尿素氮、尿肌酐均無明顯差異；模型組各時間點上大鼠體重隨時間延長未見明顯增加；與模型組1相比,模型組2大鼠尿

5、量增加、血糖明顯增高(P<0.05)。模型組1,2大鼠尿蛋白排出量呈現(xiàn)出隨病程延長逐漸增加的趨勢。
　　 結(jié)論：腹腔注射STZ可成功誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。STZ誘導(dǎo)的大鼠腎損傷隨病程延長逐漸加重,模型組2大鼠的腎損傷程度明顯重于模型組1大鼠。
　　 2 ACE2在糖尿病大鼠腎臟中的表達(dá)差異與腎損傷的關(guān)系
　　 目的：ACE2是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)新發(fā)現(xiàn)的一種酶,已證實ACE2在組織損傷中發(fā)揮積極作用,但機(jī)

6、理尚不清楚。本研究通過觀察ACE2在不同病程的糖尿病腎損傷大鼠腎臟中mRNA和蛋白表達(dá)及循環(huán)中AngⅡ水平的變化,探尋ACE2在糖尿病腎損傷發(fā)生發(fā)展中的變化及其作用。
　　 方法：上一章對照組1(15天大鼠)、對照組2(30天大鼠)、模型組1(15天大鼠)和模型組2(30天大鼠)各8只,取腎臟組織和血清進(jìn)行如下試驗:(1)RT-PCR法分析腎組織中ACE2 mRNA水平變化；(2)Western blot法檢測腎組織中ACE2蛋

7、白水平變化；(3)免疫組化SABC法對腎臟組織中ACE2蛋白進(jìn)行細(xì)胞組織定位；(4)放射免疫法測定血清中AngⅡ含量。
　　 結(jié)果：(1)與對照組相比,模型組1大鼠腎組織中ACE2 mRNA表達(dá)下降(P>0.05),模型組2ACE2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；(2)與對照組相比,模型組1大鼠腎組織中ACE2蛋白水平顯著升高(P<0.05),模型組2 ACE2蛋白表達(dá)下降(P>0.05)；(3)免疫組化結(jié)果顯示:ACE

8、2主要位于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜；ACE2陽性顆粒統(tǒng)計結(jié)果顯示與對照組相比,模型組1大鼠腎組織中ACE2蛋白水平顯著升高(P<0.05),模型組2 ACE2蛋白表達(dá)較對照組下降(P>0.05),變化趨勢與Western blot檢測結(jié)果相同；(4)放射免疫測定結(jié)果顯示:與對照組相比,模型組1血清中AngⅡ含量稍有升高,差異不顯著(P>0.05),而模型組2血清中AngⅡ含量顯著升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論： ACE2在腎臟

9、內(nèi)的表達(dá)隨糖尿病腎損傷的發(fā)展呈下降趨勢.在早期,ACE2表達(dá)上調(diào),提示ACE2在腎臟病變的早期階段有積極的保護(hù)作用。在晚期ACE2表達(dá)下調(diào),循環(huán)中AngⅡ水平高,可能與糖尿病和腎損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān),導(dǎo)致了糖尿病腎損傷的進(jìn)展。
　　 3 ACE2的抗損傷作用及其機(jī)制初探
　　 目的：本研究上一章的研究發(fā)現(xiàn)ACE2參與了糖尿病大鼠腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程,本試驗通過比較腎臟組織中ACE-AngⅡ-AT1/ACE2-Ang-(1-

10、7)-Mas及RAS相關(guān)調(diào)節(jié)因子在腎損傷過程中的表達(dá)差異,探討ACE/ACE2在糖尿病大鼠腎臟損傷發(fā)生發(fā)展中相互負(fù)向調(diào)節(jié)與腎損傷的關(guān)系,從分子水平上探討ACE2的抗損傷作用及其分子機(jī)制。
　　 方法：上一章對照組1(15天大鼠)、對照組2(30天大鼠)、模型組1(15天大鼠)和模型組2(30天大鼠)各8只,斷頭處死,采集血液、腎臟組織。RT-PCR法比較15天大鼠和30天大鼠腎臟組織中ACE,AT1,ACE2和Mas mRNA的

11、表達(dá)水平；放免法測定腎臟局部組織中腎素活性和AngⅠ、AngⅡ含量。
　　 結(jié)果：與對照組相比,模型組1大鼠腎臟中ACE和ACE2的mRNA水平均稍有下降(P>0.05),ACE/ACE2 mRNA比值下降；模型組2大鼠腎臟中ACE和ACE2 mRNA較對照組顯著升高(P<0.05),ACE/ACE2 mRNA比值升高。兩模型組大鼠腎臟組織中Mas、AT1 mRNA表達(dá)與對照組相比沒有顯著性變化(P>0.05)；腎臟局部組織中腎

12、素活性和AngⅠ含量,模型組1顯著低于對照組(P<0.05),而模型組2均顯著高于對照組(P<0.01)；模型組1腎臟局部組織中AngⅡ含量稍有升高,差異不顯著(P>0.05),而模型組2較對照組顯著升高(P<0.05).
　　 結(jié)論:腎損傷時腎臟局部RAS被激活,ACE與ACE2表達(dá)失調(diào)是糖尿病大鼠腎損傷發(fā)生發(fā)展的主要原因之一.損傷初期腎臟局部ACE2的激活程度強(qiáng)于ACE,以ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的激活占優(yōu)勢,