局部腎素血管緊張素系統(tǒng)中ACE2對心肌纖維化的影響.pdf

1、本研究分為三部分: 第一部分 研究目的:　 以往圍繞腎素血管緊張素系統(tǒng)（Renin Angiotensin System, RAS）對心肌纖維化影響的研究多是分別用不同的RAS組分去干預(yù)成纖維細(xì)胞，或在動物整體水平去觀察相應(yīng)的變化。由于RAS各組分之間是一個相互影響的網(wǎng)狀體系，單用某個RAS組分去干預(yù)往往不能全面地反映RAS的影響。動物整體水平研究則不可避免地將局部RAS和循環(huán)RAS混雜在一起，難以闡明局部RAS

2、的作用。因此體外構(gòu)建局部RAS對這一研究將是非常有利的。本研究擬從基因和代謝的角度驗證體外構(gòu)建局部RAS對大鼠心肌纖維化影響體外模型的可行性。 研究方法: 原代培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞；用RT-PCR鑒定大鼠心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞和大鼠H9C2細(xì)胞RAS各組分基因的表達(dá)；用放免法檢測依那普利阻斷血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）后心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中血管緊張素II（AngII）的量是否有變化，結(jié)合Western-b

3、lot驗證ACE2的存在，進(jìn)一步確定局部RAS的存在；以Transwell共培養(yǎng)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞構(gòu)建局部RAS影響心肌纖維化的體外模型。同時驗證大鼠H9C2細(xì)胞替代大鼠心肌細(xì)胞的可行性。 研究結(jié)果:　 在心肌細(xì)胞和H9C2細(xì)胞中均檢測到RAS各組分基因的表達(dá)，但在成纖維細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)腎素和ACE2的表達(dá)。對心肌細(xì)胞用依那普利干預(yù)后AngII呈劑量依賴性地下降，10-7mol/L組（36.24+3.27pg/ml）與

4、對照組（44.08+0.76 pg/ml）有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；對H9C2細(xì)胞用依那普利干預(yù)后AngII也具有相似的下降趨勢，與對照組（57.35+3.69 pg/ml）相比10-7mol/L組（41.76+3.91pg/ml）和10-8mol/L組（50.18+7.68pg/ml）均有明顯降低（P<0.05）。以Transwell共培養(yǎng)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，在氯沙坦存在的情況下培養(yǎng)基中AngII含量（63.96+3.01

5、pg/ml）較單純心肌細(xì)胞加氯沙坦組（53.59+3.14 pg/ml）明顯升高（P<0.05）；H9C2細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在氯沙坦存在情況下，共培養(yǎng)體系中AngII含量（68.96+1.35 pg/ml）較單純H9C2細(xì)胞加氯沙坦組（64.30+1.58 pg/ml）也明顯升高（P<0.05）。Western-blotting證實心肌細(xì)胞和H9C2細(xì)胞在蛋白水平均有ACE2的表達(dá)。 研究結(jié)論:　 以Transwell體外

6、共培養(yǎng)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞能夠建立一個用于研究局部RAS對心肌纖維化影響的體外模型，大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞能夠替代心肌細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系。 第二部分 研究目的:　 ACE2能夠直接降解AngII，也是體內(nèi)唯一的直接針對AngII的降解酶。而AngII對高血壓的發(fā)生、發(fā)展以及靶器官損害起到關(guān)鍵性的作用。因此，調(diào)控ACE2的表達(dá)借以研究其對AngII的影響對理解RAS的作用機(jī)理有重要意義。但目前能夠下調(diào)ACE

7、2表達(dá)的手段尚不多。本研究設(shè)計、合成針對大鼠心肌H9C2細(xì)胞的siRNA對ACE2進(jìn)行抑制，并對其抑制效果從基因和蛋白水平進(jìn)行評價。 研究方法:　 根據(jù)大鼠ACE2基因序列設(shè)計并化學(xué)合成3條siRNA及1條陰性對照siRNA，并分別在5’端標(biāo)記FAM熒光。對3條siRNA序列應(yīng)用Blast軟件在全基因組進(jìn)行比對, 確定獲得的序列為大鼠AEC2的特異序列，陰性對照序列為與任何物種均無同源性的序列。以Lipofectamin

8、e 2000轉(zhuǎn)染入大鼠心肌H9C2細(xì)胞，觀察FAM熒光的陽性比例作為評價轉(zhuǎn)染效率的指標(biāo)。用Realtime Quantative RT-PCR和Western-blotting分別檢測ACE2基因和蛋白表達(dá)量的改變、驗證所設(shè)計的siRNA的抑制效應(yīng)。 研究結(jié)果:　 以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染所設(shè)計的siRNA進(jìn)入H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率大于95％。起始于434、567位點的siRNA在基因水平對ACE2無明

9、顯抑制效應(yīng)（P>0.05）；起始于1205位點的siRNA在基因和蛋白水平均對ACE2有明顯的抑制效應(yīng)，基因水平下降73.50％（P<0.05）；蛋白水平下降70.02％（P<0.01）。 研究結(jié)論:　 起始于1205位點的siRNA對大鼠心肌H9C2細(xì)胞ACE2有明顯的抑制效應(yīng)。 第三部分 研究目的:　 在影響心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的諸多因素中，AngII 起著至為關(guān)鍵的作用。AngII可以獨立于

10、壓力負(fù)荷之外單獨作用于心肌成纖維細(xì)胞AT1受體，呈劑量依賴性地促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌。在心臟內(nèi)，AngⅡ既可以由循環(huán)腎素－血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin-Systerm, RAS)產(chǎn)生，也可以由局部RAS產(chǎn)生。就其對心肌重塑的影響而言，局部RAS可能起到更大的作用。因此，揭示機(jī)體對AngⅡ生成的影響方式和途徑，尤其是在局部RAS中的作用過程將為防止和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化提供有益的思路。ACE2是體內(nèi)唯一的

11、直接針對AngII的降解酶，因此ACE2表達(dá)的改變可能對心肌纖維化產(chǎn)生影響。本研究以RNAi抑制ACE2基因的表達(dá)，借助于H9C2細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)觀察ACE2對心肌纖維化的影響。 研究方法:　 用Transwell共培養(yǎng)H9C2細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞；以RNAi抑制H9C2細(xì)胞ACE2基因的表達(dá)；以放射免疫法測定共培養(yǎng)體系上清液的AngII濃度；流式細(xì)胞術(shù)測定心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況；用Realtime

12、Quantitative RT-PCR檢測心肌成纖維細(xì)胞I、III型膠原基因表達(dá)情況；用[3H]-proline檢測心肌成纖維細(xì)胞膠原生成情況。 研究結(jié)果:　 RNAi抑制ACE2的H9C2細(xì)胞和正常H9C2細(xì)胞分別與心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，RNAi組培養(yǎng)基上清中的AngII濃度明顯高于正常對照組（78.60+3.32 vs.68.96+1.35, P <0.01）。流式細(xì)胞術(shù)測定心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期RNAi組S期百

13、分比較正常對照組有明顯的升高（14.31+1.80 vs. 8.60+2.83, P<0.05），PI也較正常對照組有明顯升高（22.03+1.83 vs. 17.07+1.94, P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)測定心肌成纖維細(xì)胞的凋亡，RNAi組細(xì)胞凋亡百分比較正常對照組有明顯下降（8.80+1.04 vs. 12.0+0.76, P<0.05）。Realtime Quantitative RT-PCR檢測心肌成纖維細(xì)胞I、III型膠原基