血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2對(duì)于膠原及其限速亞單位P4Hα1的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　膠原是人體中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是血管壁結(jié)構(gòu)中最常見的膠原蛋白亞型，其分泌和降解的平衡是維持細(xì)胞外基質(zhì)正常，增加動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定以及降低血管壁破裂的重要因素。
　　眾所周知，4羥基-脯氨酸羥化酶（P4H）對(duì)于膠原蛋白的生物合成具有重要作用，它是一個(gè)具有兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基的四聚體，其中，α亞基決定其生物活性，足量的P4Hα1可以促進(jìn)膠原蛋白的合成，而P4Hα1表達(dá)的降低也可相

2、應(yīng)減少膠原蛋白的含量。
　　在人體內(nèi)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，血管緊張素 Ⅱ（AngⅡ）可以引起血管收縮，血管平滑肌細(xì)胞增殖肥大以及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。有關(guān)研究已經(jīng)證明 AngⅡ可以抑制P4Hα1的活性和降低膠原的合成以破壞 ECM的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定和破裂。在腎素血管緊張素系統(tǒng)中的另一物質(zhì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2），具有與 AngⅡ的反作用，可發(fā)揮很強(qiáng)的抗炎癥反應(yīng)作用，并可促進(jìn)膠原

3、的合成以及斑塊的穩(wěn)定，而且可將 AngⅡ水解為血管緊張素（1-7）（Ang（1-7）），后者作為 AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子，可與 AngⅡ產(chǎn)生對(duì)抗作用。
　　目的：
　　1.在體外實(shí)驗(yàn)中，觀察 ACE2是否可以促進(jìn) P4Hα1的表達(dá)并增加膠原蛋白含量。
　　2.在體外實(shí)驗(yàn)中，研究并探討 ACE2對(duì)于 P4Hα1以及膠原合成的作用機(jī)制和途徑。
　　方法：
　　ACE2重組腺病毒的制備
　　通過 AdMa

4、x系統(tǒng)制備攜帶 ACE2的重組腺病毒（AdACE2）以及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的重組腺病毒（AdEGFP）。
　　對(duì)細(xì)胞的預(yù)處理
　　用10-6mol/L的AngⅡ刺激平滑肌細(xì)胞24小時(shí)。24小時(shí)候再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組刺激。
　　對(duì)細(xì)胞的刺激
　　用106pfu AdEGFP刺激細(xì)胞24小時(shí)以及用相同劑量的AdACE2刺激細(xì)胞24,48,72小時(shí)來研究 ACE2對(duì) P4Hα1的作用。為了研究 Ang（1-

5、7）的作用，在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激細(xì)胞2,4,8,16,24小時(shí)；在劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分別刺激細(xì)胞24小時(shí)。接下來，為了分析 ACE2的作用機(jī)制，用Ang(1-7)的抑制劑 A779來作對(duì)比，將實(shí)驗(yàn)分為六組，每組刺激24小時(shí)，除了ACE2為106pfu外，Ang(1-7)和A779都是10-6mol/L，具體分組為對(duì)照組，

6、AdACE2組，AdACE2+A779組，Ang(1-7)組,Ang(1-7)+A779組和A779組。
　　實(shí)時(shí)定量 RT-PCR
　　細(xì)胞刺激結(jié)束后，提取細(xì)胞的RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) P4Hα1的mRNA含量，并通過β-actin的CT值進(jìn)行校準(zhǔn)。
　　Western blot
　　提取經(jīng)過刺激的細(xì)胞的蛋白質(zhì)后，通過進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，談后標(biāo)記一抗和二抗，進(jìn)而曝光，最后可以觀察到目的

7、蛋白的表達(dá)。
　　ELISA
　　將細(xì)胞的上清液提取出來以后，使用ELISA試劑盒分析得出膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)含量。
　　結(jié)果：
　　ACE2促進(jìn) P4Hα1的表達(dá)
　　在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，用106pfu AdACE2分別刺激細(xì)胞24,48,72小時(shí)，通過 RT-PCR發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后，P4Hα1的表達(dá)最強(qiáng)烈，明顯高于其他各組，到48小時(shí)時(shí)表達(dá)已降低，72小時(shí)與48小時(shí)時(shí)差別不大，但都高于對(duì)照組以及AdEGFP

8、組。
　　Ang(1-7)增加 P4Hα1的表達(dá)
　　對(duì)于 Ang(1-7)對(duì) P4Hα1的作用效果，在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激細(xì)胞2,4,8,16,24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)其效果隨時(shí)間逐步上升并在24小時(shí)時(shí)達(dá)到最高且明顯高于對(duì)照組；在劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分別刺激細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示，其作用效果隨濃度的上升而上升，在其后的實(shí)

9、驗(yàn)中，選取10-6mol/L作為 Ang(1-7)的作用濃度。
　　A779抑制ACE2和Ang（1-7）對(duì)于 P4Hα1的作用
　　為了研究 ACE2對(duì)于 P4Hα1的作用機(jī)制，除了用AdACE2和Ang(1-7)刺激細(xì)胞外，還使用了Ang(1-7)的抑制劑 A779與兩者混合刺激。根據(jù) RT-PCR以及Western的結(jié)果，單純 Ang(1-7)的刺激要比單純 ACE2的刺激作用大的多，加入抑制劑后，A779可以幾乎全部

10、抑制Ang(1-7)的作用但是只是部分抑制了ACE2，單純的A779刺激使得 P4Hα1表達(dá)比對(duì)照組更低。說明 ACE2對(duì) P4Hα1的作用途徑是通過對(duì) AngⅡ的降解來提高 Ang(1-7)，而Ang(1-7)是直接產(chǎn)生促進(jìn)作用。
　　ACE2提高膠原蛋白的含量
　　通過 ELISA分析，膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的含量在 ACE2和Ang(1-7)刺激下明顯升高，且前者高于后者。A779加入后，ACE2的作用大約60％被抑制，而An