睪丸注射LV載體及安全性評(píng)定.pdf

1、慢病毒(Lentivirus)是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒，含有依賴于RNA的多聚酶即逆轉(zhuǎn)錄酶，可侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，在自身逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA，以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，通過(guò)病毒整合酶作用整合到宿主細(xì)胞的基因組中。以慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的慢病毒載體(Lentiviral vector)具有轉(zhuǎn)移效率高、免疫反應(yīng)小、作用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
　　 睪丸注射法即將病毒包裝的外源DNA直接注射到雄性動(dòng)物睪丸內(nèi)，感染精原細(xì)

2、胞或精原干細(xì)胞后將外源基因轉(zhuǎn)染到精子，然后利用體外授精、人工授精等技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)。該方法操作簡(jiǎn)便，但是否安全、有效，尚待驗(yàn)證。
　　 本試驗(yàn)通過(guò)分析經(jīng)睪丸注射后的牛血液和精液指標(biāo)，并用PCR方法檢測(cè)外源DNA在睪丸內(nèi)與精子整合后是否擴(kuò)散到全身組織中；應(yīng)用電子顯微鏡鏡技術(shù)研究睪丸注射LV載體對(duì)牛睪丸組織的影響，旨在探討睪丸注射法的安全性和效果，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　 本課題研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩個(gè)

3、部分：
　　 1.睪丸注射慢病毒對(duì)精液品質(zhì)的影響
　　 本試驗(yàn)采用多點(diǎn)睪丸注射，注射后對(duì)實(shí)驗(yàn)牛多次采精，對(duì)精液進(jìn)行精液常規(guī)品質(zhì)檢測(cè)，主要指標(biāo)為密度、活力和外觀色澤。將精液制成涂片，置于400倍電子顯微鏡下觀察精子形態(tài)及密度。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組牛精液密度、活力略低于對(duì)照組牛精液，但是相差不大。在400倍電子顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組精子密度低于對(duì)照組，精子形態(tài)正常，畸形精子率低。
　　 2.血液、精液外

4、源DNA檢測(cè)
　　 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)血液常規(guī)指標(biāo)分析及外源基因的PCR擴(kuò)增，來(lái)確定慢病毒載體在宿主體內(nèi)是否發(fā)生基因轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到其他組織中。本實(shí)驗(yàn)室PCR方法靈敏度可達(dá)到10個(gè)拷貝數(shù)，對(duì)外源BSD基因進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在血液DNA及精液DNA中均未檢測(cè)到外源BSD序列。
　　 3.睪丸注射慢病毒對(duì)血液生理生化指標(biāo)影響
　　 血常規(guī)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)利用Microsoft