雞源抗腹瀉芽孢益生菌J-4菌株的篩選、鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及動物飼喂試驗.pdf

1、近些年,疫病的不斷出現(xiàn),成為制約養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要因素,尤其是雞大腸桿菌性腹瀉大面積發(fā)生,傳染性強,死亡率高。目前,雞飼料中普遍使用亞治療劑量的抗生素類添加劑抑制和殺滅病原菌,這給養(yǎng)殖業(yè)帶來一系列問題。首先在殺病原菌的同時也抑殺了雞體內(nèi)正常共生的菌群,破壞了微生態(tài)平衡；其次使雞體內(nèi)的耐藥病原菌或變異病原菌不斷產(chǎn)生；更嚴重的是雞不斷向環(huán)境中排泄這些抗生素或其代謝產(chǎn)物,使環(huán)境中的耐藥病原菌與變異病原菌不斷出現(xiàn)。這迫使養(yǎng)殖戶增加抗生素用藥量,更

2、新用藥品種,從而造成了變異病原菌高耐藥性,腸道微生態(tài)環(huán)境進一步破壞。
　　 大量研究表明微生態(tài)制劑可調(diào)整機體的微生態(tài)平衡,在防治腹瀉的同時也避免了耐藥性的產(chǎn)生,有著抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)點,非常具有發(fā)展?jié)摿?世界各國陸續(xù)積極地倡導(dǎo)和推廣,使其受到矚目。
　　 本試驗從健康青年雞糞便中分離得到的300株產(chǎn)芽孢菌株中分離得到152株菌具有體外抗大腸桿菌活性,其中J-4菌株的抗菌活性最強。對該菌株進行了菌落、菌體、芽孢形態(tài)觀察,生

3、理生化鑒定和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 微生態(tài)制劑分泌的抗菌肽具有較高抗菌活性、易降解等優(yōu)點。本試驗對J-4菌株的發(fā)酵液進行了分析,分別采用有機溶劑萃取,鹽析,蛋白酶敏感性試驗,酸耐受性試驗,高溫耐受性試驗,初步斷定該菌株分泌的抗菌物質(zhì)是肽類。
　　 大多數(shù)益生菌在體外具有良好的抗菌活性,而到體內(nèi)往往失效,其主要因為是消化道內(nèi)的胃酸、膽鹽、腸液,使菌

4、體死亡。為了克服這些缺陷,對J-4菌株進行了胃酸、膽鹽、腸液耐受性試驗,在pH值為2.0環(huán)境中3 h仍能存活90％,能夠耐受0.3％的膽鹽,在腸液中3 h存活率為80％,適宜在消化道內(nèi)存活和定植。J-4芽孢80℃保溫70 min后仍有88％以上存活,有望成為益生菌菌株。
　　 為了提高防治腹瀉的芽孢益生菌發(fā)酵液菌體濃度,對J-4菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,通過單因素試驗和正交試驗發(fā)現(xiàn)玉米粉為最佳碳源,花生餅粉為最佳氮源,MnSO4

5、·H2O為最佳無機鹽,確定J-4的最佳發(fā)酵條件為:玉米粉1％,花生餅粉2％,MnSO4·H2O0.07％,NaH2PO4·2H2O0.2％,Na2HPO4·2H2O0.4％,初始pH7.0,三角瓶裝液量為30 mL／250 mL,接種量2％,搖瓶轉(zhuǎn)速220 r／min,發(fā)酵溫度37℃。培養(yǎng)條件優(yōu)化后發(fā)酵液濃度顯著提高:優(yōu)化前發(fā)酵菌體濃度最高為2.23×108 cfu／mL,優(yōu)化后可達1.83×109cfu／mL,提高了7.2倍,而芽孢率

6、在95％以上,為該菌的進一步研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 將J-4菌株發(fā)酵液進行了小白鼠和雛雞飼喂的安全性試驗,15天后未發(fā)現(xiàn)小白鼠和雛雞臟器、腸道的任何病變,證明此菌株為枯草芽孢桿菌安全菌株。為了進一步研究該菌的防治腹瀉效果,建立了小白鼠大腸桿菌性腹瀉模型,用J-4菌株發(fā)酵液進行飼喂,發(fā)現(xiàn)飼喂后小鼠盲腸內(nèi)乳酸菌有益菌增多,而大腸桿菌等有害菌明顯減少,試驗組腹瀉率和死亡率明顯低于空白對照組；又建立了雞的大腸桿菌性腹瀉模型,J-4