灰樹花子實體富硒及其硒多糖的研究.pdf

1、硒(Se)是人體必需的微量元素，是重要含硒酶（谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶等）的必需組分，具有提高機體免疫能力、抗腫瘤、緩解體內重金屬蓄積、抗衰老和防止心血管疾病等活性。人體缺硒會導致免疫能力下降、癌癥、克山病和大骨節(jié)病等的發(fā)生，危害人體健康，但日常膳食不能滿足人體對硒的最低需要，因此硒的營養(yǎng)補充尤為重要。研究表明，食用菌具有很好的富硒能力，但由于栽培基質缺硒，導致食用菌中的含硒量低，因此采用人工富硒方式增加栽培基質硒含量或菌面

2、噴施無機硒，是獲得富硒食用菌子實體行之有效的方法。灰樹花（Grifola frondosa， Maitake）隸屬擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，樹花屬，是一種藥食兩用真菌，多糖是其主要活性物質，具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化等活性，灰樹花子實體富硒后，其硒多糖兼具硒和多糖的活性，具有重要的研究價值和應用前景，而目前關于灰樹花子實體富硒及其硒多糖的研究鮮見報道。本文通過富硒栽培，獲得富硒灰樹花子實體，研究其中硒的主要賦存形式;采用DEAE-

3、52和Sephacryl S-400對富硒灰樹花子實體粗硒多糖進行分離和純化，獲得富硒灰樹花子實體硒多糖組分(Se-GP11)，并采用HPLC、GC、GC-MS、NMR、AFM、TEM及CD等現(xiàn)代分析手段對其進行全面結構分析;采用Heps荷瘤小鼠模型，研究Se-GP11的體內抗腫瘤活性、對5-氟尿嘧啶(5-Fu)的減毒作用及其免疫機制，為富硒灰樹花子實體及其硒多糖在食品和醫(yī)藥領域中的應用提供依據，該研究對人類健康和社會發(fā)展具有重要意義。

4、本文主要研究內容如下:
　　(1)灰樹花子實體富硒及其硒的賦存形式研究。建立了富硒灰樹花子實體中硒含量的氫化物-原子熒光光譜測定方法，最佳檢測條件為:燈電流80 mA、負高壓280 V、載流鹽酸濃度10％、硼氫化鈉濃度1.0％;采用菌面和拌料施硒兩種種植方式對灰樹花進行富硒研究，結果表明菌面噴施亞硒酸鈉5.785mg/段和袋料拌施57.143 mg/段時，其富硒的效果較好，產量分別為28和24 g/段，有機硒含量為11.98和20

5、.36μg/g，分別占總硒的87.19％和61.51％，說明菌面噴施硒的富硒效果優(yōu)于袋料拌硒，其有機硒含量是未富硒灰樹花子實體的98.81倍，因此富硒灰樹花子實體粉可以作為硒營養(yǎng)強化劑;研究了富硒灰樹花子實體中硒的賦存形式，結果表明硒多糖和硒蛋白是富硒灰樹花子實體中硒的主要賦存形式，分別占有機硒的13.68％和57.52％。
　　(2)富硒灰樹花子實體粉及其粗硒多糖的抗腫瘤活性和經口急性毒性研究。采用Heps和Lewis荷瘤小鼠模

6、型，比較了富硒灰樹花子實體粉及其粗硒多糖與未富硒灰樹花子實體粉的體內抗腫瘤活性，結果表明，三者對Heps荷瘤小鼠的效果優(yōu)于Lewis荷瘤小鼠，其中粗硒多糖的抑瘤活性最好，抑瘤率達20.63％(環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組為36.26％），其次為富硒灰樹花子實體粉，未富硒灰樹花子實體粉最低，僅為1.92％;小鼠經口急性毒性研究表明，富硒灰樹花子實體粉及其粗硒多糖屬于實際無毒級，其經口LD50均大于15.1 g/kg b.w.。
　　

7、(3)富硒灰樹花子實體硒多糖的提取、分離純化及結構鑒定。采用響應面分析法(RSM)研究富硒灰樹花子實體粗硒多糖的提取工藝，最佳提取工藝條件為:提取溫度100℃、提取時間2.6 h、料液比1∶34.7，該工藝條件下富硒灰樹花子實體粗硒多糖得率為15.37％，粗多糖含量為48.68％;采用DEAE-52，Sephacryl S-400對富硒前后灰樹花子實體粗多糖進行分離純化，兩者皆獲得了3個多糖組分，除硒含量外，其多糖含量、分子量和單糖組成

8、均無顯著差異，其中富硒及未富硒灰樹花多糖水洗純化硒多糖組分Se-GP11和多糖組分GP11的量較多;紅外分析表明Se-GP11和GP11表現(xiàn)為相同的特征吸收峰，富硒后使得吡喃糖環(huán)上的3個特征峰發(fā)生了紅移，因此硒可能是以Se-H鍵的形式存在于Se-GP11的支鏈上;通過甲基化、GC-MS、1HNMR、13C NMR、1H-1H COSY譜、HSQC譜和HMBC譜等分析手段對Se-GP11的一級化學結構進行解析，確定其一級結構的重復單元為:

9、→4)-α-D-Glcp-(1→{6)-β-D-Galp(1→3)-α-D-1)-α-D-Glcp(↓)2 Glcp6(↑)1)-α-D-Glcp(1→6)-β-D-Galp(1}3→6)-β-D-Manp(1→采用CD、激光粒度測定、AFM和TEM等方法對Se-GP11的構象及分子形貌進行研究。CD譜研究表明，溫度、離子強度、pH和絡合物等環(huán)境條件改變均影響其立體構象及非對稱性;激光粒度測定結果表明，Se-GP11粒度分布較均勻，粒徑

10、為690 nm，分散度為0.208; AFM觀察發(fā)現(xiàn)，溫度改變了Se-GP11形貌，常溫下Se-GP11多糖分子鏈縱橫交錯，形成立體多層網狀，加熱處理冷卻后，Se-GP11清晰的鏈結構發(fā)生了變化，有形成不規(guī)則聚集體的趨勢;TEM觀察發(fā)現(xiàn)Se-GP11在水溶液中聚結成網絡狀。
　　(4) Se-GP11的抗腫瘤活性及其對5-Fu的減毒作用研究。采用Heps荷瘤小鼠模型，考察Se-GP11的體內抗腫瘤活性及其對5-Fu的減毒作用。結果

11、表明，Se-GP11活性顯著高于GP11，在劑量為54 mg/kg時，Se-GP11的抑制率達64.38％，接近5-Fu陽性對照組的抑瘤率(68.58％); Se-GP11可顯著提高荷瘤小鼠胸腺指數、血清中IL-2和TNF-α水平，外周血白細胞的數量，肝臟的SOD活力，可使血清中AST水平恢復正常，降低肝臟中MDA水平;對5-Fu的減毒研究表明，Se-GP11效果顯著好于GP11，Se-GP11可明顯對抗5-Fu所引起的小鼠免疫器官指數

12、、外周血白細胞數量的減少和機體TNF-α、IL-2水平的降低，此外，Se-GP11對5-Fu所引起的肝損傷具有一定的改善作用?？梢?，Se-GP11具有較好的抗腫瘤和對5-Fu的減毒作用，效果優(yōu)于GP11且對機體無毒。
　　(5) Se-GP11抗腫瘤免疫機制研究。以腹腔巨噬細胞RAW264.7為研究對象，研究了Se-GP11對腹腔巨噬細胞的免疫調節(jié)機制。結果表明，Se-GP11可顯著提高RAW264.7中性紅吞噬能力，效果優(yōu)于GP

13、11;MTT實驗結果表明，1000μg/mL的Se-GP11對RAW264.7細胞無明顯的毒性作用;經Se-GP11誘導的RAW264.7細胞及其上清液均可顯著抑制HepG-2細胞的增殖且Se-GP11的活性高于GP11; Se-GP11可顯著提高RAW264.7細胞釋放NO，TNF-α和IL-1β的能力且顯著高于GP11;Western blot和RT-PCR法研究表明， Se-GP11可顯著上調iNOS蛋白、iNOS和TNF-α m