慢病毒載體介導(dǎo)RNAi法抑制小鼠卵泡顆粒細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A表達(dá)的研究.pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是胱氨酸結(jié)生長因子中的血小板起源的生長因子亞家族，胱氨酸結(jié)生長因子作為細(xì)胞產(chǎn)生的一個(gè)信號蛋白來刺激血管發(fā)生和血管生成。VEGF的正常功能是在胚胎發(fā)育中、損傷之后、運(yùn)動之后肌肉中產(chǎn)生新的血管以及繞過阻塞血管產(chǎn)生新的血管。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF在顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)增值和分化中起到重要的作用，并且通過RNA干擾（RNA interference，RNA

2、i）上調(diào)和下調(diào)VEGF可以提供一個(gè)強(qiáng)大的工具來研究VEGF在這些細(xì)胞中發(fā)揮功能的細(xì)節(jié)。RNAi是一個(gè)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，它是由一個(gè)感興趣的特異性基因的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的引入而引發(fā)的。最近，研究者已經(jīng)將短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)整合到慢病毒載體中，以此成功傳遞siRNA到哺乳動物細(xì)胞中并獲得穩(wěn)定基因沉默。VEGF的shRNA可作為潛在的策略來敲

3、低VEGF，并檢測shRNA對小鼠顆粒細(xì)胞(mouse granulosa cells，MGC)中VEGF受體及凋亡基因的影響。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了四種靶向小鼠VEGF A基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，并探索這些質(zhì)粒對體外培養(yǎng)的MGC中VEGF表達(dá)的影響。我們設(shè)計(jì)了四種不同的靶向小鼠VEGF A基因mRNA編碼序列的shRNA和一個(gè)陰性對照shRNA(negativecontrol shRNA，shNC)，并把他們分別克隆到pGPU6

4、/GFP/Neo siRNA表達(dá)載體中，然后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MGC中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后從細(xì)胞中提取總RNA，并做qRT-PCR分析。使用其中最有效的干擾質(zhì)粒shVEGF1487來構(gòu)建慢病毒載體，并將這個(gè)慢病毒載體通過lipofectamineTM2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，來生產(chǎn)慢病毒，然后超速離心濃縮。使用濃縮后的慢病毒侵染MGC后，我們通過qRT-PCR檢測VEGF A基因、凋亡基因及VEGF A受體基因的表達(dá);通過酶

5、聯(lián)免疫吸附測定培養(yǎng)基中VEGF A蛋白水平;通過蛋白印跡檢測MGC中VEGF A蛋白水平。與shNC和對照比較，四種shVEGF載體均能顯著的敲低VEGF A基因、受體基因和凋亡基因。慢病毒載體也能顯著敲低VEGF A基因。shVEGFs組培養(yǎng)基中的蛋白含量低于shNC和空白組。在蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)shVEGF組中蛋白水平低于shNC和空白組，只有VEGF1359高于shNC組但低于空白組。慢病毒侵染的MGC也表現(xiàn)出低的蛋白水平。這些