慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞α1，3GT表達(dá)的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用RNAi(RNAinterference)技術(shù)探討靶向α1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1,3GT)的shRNA重組慢病毒載體抑制小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞α1,3GT和α1,3半乳糖殘基Galα(1,3)Gal表達(dá)的可行性。 方法：采用組織植塊法體外培養(yǎng)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞；經(jīng)體外設(shè)計(jì)合成針對(duì)α1,3GTmRNA的序列特異性shRNA,并構(gòu)建攜帶α1,3GTshRNA的重組慢病毒載體，以慢病毒感染小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞系EOMA；熒光實(shí)時(shí)定量

2、PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后α1,3GTmRNA表達(dá)水平的變化，免疫熒光檢測(cè)異種抗原Galα(1,3)Gal表達(dá)水平的變化；使用SPSS13.0forWindows進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：體外組織植塊培養(yǎng)可獲得純度較高的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞；成功構(gòu)建了重組慢病毒載體質(zhì)粒。經(jīng)病毒包裝后，得到了攜帶α1,3GT-shRNA的成熟的重組慢病毒顆粒；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示構(gòu)建的重組慢病毒轉(zhuǎn)染EOMA，能抑制α1,3GT的表達(dá)，抑制率約為88％(P<0

3、.01)?？詹《据d體對(duì)照組、陰性siRNA對(duì)照組與未處理細(xì)胞組的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05)；免疫熒光檢測(cè)顯示α1,3GT-shRNA重組慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Galα(1,3)Gal抗原水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，空病毒載體對(duì)照組、陰性siRNA對(duì)照組與未處理細(xì)胞組間的Galα(1,3)Gal抗原表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：通過組織植塊法可實(shí)現(xiàn)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳代，但傳代的次數(shù)有限

4、；本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了靶向α1,3GT基因的重組慢病毒載體，并利用該慢病毒載體成功地將α1,3GT-shRNA表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)入EOMA細(xì)胞，使其持續(xù)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了靶向α1,3GT基因的RNA干擾。重組慢病毒載體有效地抑制了α1,3GTmRNA，并且抑制了其所催化的蛋白Galα(1,3)Gal的表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)，初步說明慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)對(duì)沉默α1,3GT基因從而下調(diào)異種抗原Galα(1,3)Gal表達(dá)的策略是可行的。從而為進(jìn)一步研究利用