hBax和hHGF雙基因共表達(dá)慢病毒的構(gòu)建及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：包裝增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的表達(dá)hBax和hHGF雙基因的慢病毒載體,觀察慢病毒感染后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的影響。
　　 方法：通過重疊PCR技術(shù)和gatewaytechnology技術(shù)構(gòu)建攜帶目的基因的陽性質(zhì)粒和儀攜帶綠色熒光蛋白的陰性質(zhì)粒并測(cè)序,上述兩種質(zhì)粒分別和輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝病毒,利用熒光顯微鏡來檢測(cè)病毒滴度。本實(shí)驗(yàn)選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)和小鼠胚胎成纖維

2、細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)作為研究的目的細(xì)胞,利用包裝成功的慢病毒感染目的細(xì)胞,根據(jù)對(duì)目的細(xì)胞的處理不同,試驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(感染了攜帶Bax和HGF雙目的基因的慢病毒)、陰性對(duì)照組(感染了僅攜帶有綠色熒光蛋白的慢病毒)和空白組(未做任何處理的正常細(xì)胞)3組。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)染毒后各組細(xì)胞Bax和HGF的表達(dá)情況;在倒置顯微鏡下面觀察3組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上所發(fā)生的變化;MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞間的增殖能力是否有差異,細(xì)胞劃痕法

3、觀察HUVEC染毒后遷移能力的變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)鑒定慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功,利用熒光顯微鏡測(cè)得hBax和hHGF共表達(dá)慢病毒和僅表達(dá)綠色熒光蛋白的陰性病毒滴度分別為7.8×107TU/ml和9×107TU/ml。RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示染毒后使HUVEC表達(dá)HGF并且上調(diào)了Bax基因的表達(dá)(P＜0.05)。倒置顯微鏡下可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞變?yōu)殚L梭形或者不規(guī)則的多角形,細(xì)胞表面的突起增多;實(shí)驗(yàn)組較之其他兩組細(xì)胞,

4、其增殖能力和遷移能力都明顯的提高(P＜0.05)。NIH3T3細(xì)胞和HELF染毒后,RT-PCR和westemblot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與其他兩組相比,Bax和HGF的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05);倒置顯微鏡下可見陰性對(duì)照組的細(xì)胞與空白組的細(xì)胞生長正常。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在染毒72h后,部分細(xì)胞發(fā)生皺縮,體積縮小;96h后可見有部分貼壁細(xì)胞脫落;MTT結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較之其他兩組細(xì)胞,感染hBax和hHGF雙基因共表達(dá)慢病毒后的上述兩種細(xì)胞增殖明顯被