體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)及其分子調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、牙齒萌出是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)密調(diào)控的過程。大量研究表明，牙囊在牙齒萌出中發(fā)揮重要的作用，其中一個(gè)重要原因就是牙囊中含有一系列牙齒萌出所必需的調(diào)控因子，包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1（CSF-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，它們能夠趨化單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊并促使其形成破骨細(xì)胞，后者吸收牙槽骨形成牙齒萌出通道。 Wise 等在研究大鼠牙齒萌出過程中發(fā)現(xiàn)：破骨細(xì)胞的形成在大鼠出生后3d 達(dá)到一個(gè)高峰期，此時(shí)牙囊中的一些牙齒萌出調(diào)控

2、因子如CSF-1、MCP-1的表達(dá)均達(dá)到高峰，表明CSF-1、MCP-1 在破骨細(xì)胞形成這一高峰期發(fā)揮重要的作用。但是Wise 發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的形成在大鼠出生后10d 左右又達(dá)到一個(gè)高峰，而此時(shí)牙囊中CSF-1、MCP-1 等的表達(dá)均大大降低，因此Wise 等推測在第二個(gè)高峰期有另外一些因子促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。2003 年Wise 等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后10d 左右，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在牙囊中的表達(dá)達(dá)到高峰，推測VEGF 在破骨

3、細(xì)胞形成的第二個(gè)高峰期發(fā)揮重要作用。他們?cè)陔S后又進(jìn)行了一些研究，證實(shí)了他們的推測。 但是Wise 等的研究結(jié)果是基于嚙齒動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)論是否適用于人類的牙齒萌出還不確定，而且目前有關(guān)VEGF 在牙齒萌出中作用的研究還缺乏系統(tǒng)性。許多問題如體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞能否表達(dá)VEGF、VEGF 對(duì)人牙囊細(xì)胞的生物學(xué)作用及可能機(jī)制、其它牙齒萌出相關(guān)分子對(duì)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響、調(diào)控人牙囊細(xì)胞VEGF 表達(dá)的信號(hào)通路、VEGF 對(duì)人牙

4、囊細(xì)胞OPG、RANKL 表達(dá)的影響等均還不清楚。 本課題將在以往研究的基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞，采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)有關(guān)方法，比較系統(tǒng)地研究人牙囊細(xì)胞VEGF 表達(dá)及可能信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制、VEGF 對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響及可能機(jī)制、VEGF 參與牙齒萌出過程中破骨細(xì)胞形成和分化的機(jī)理等，以探討VEGF 參與牙齒萌出的生物學(xué)機(jī)制。本課題的結(jié)果將有助于闡明牙齒萌出的分子機(jī)制，也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的

5、組織工程研究等提供理論基礎(chǔ)。 本課題的研究內(nèi)容如下： 第一部分：體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF 的表達(dá) 目的：觀察體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞能否表達(dá)VEGF。 方法：取一名12 歲男孩因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織，采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，并選取第4 代細(xì)胞進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定其細(xì)胞來源。然后選取第4 代人牙囊細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、反轉(zhuǎn)

6、錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）三種方法檢測VEGF 的表達(dá)。 結(jié)果：在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細(xì)胞，絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證明細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)。人牙囊細(xì)胞抗VEGF染色陽性，陽性部位位于胞漿。RT-PCR 檢測到人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 的表達(dá)。在人牙囊細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測到VEGF 蛋白。 結(jié)論：用組織塊結(jié)合酶消化法在體外成

7、功培養(yǎng)出人牙囊細(xì)胞，經(jīng)鑒定細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)。體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞能夠合成并分泌VEGF。 第二部分：VEGF 對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的：觀察VEGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響并探討可能的作用機(jī)制。 方法：將生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，分別與不同濃度的VEGF孵育3d或與100ng/mL VEGF孵育不同時(shí)間，檢測VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活

8、性的影響。將VEGF和MAPK抑制劑不同組合加入到96孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中，檢測MAPK抑制劑對(duì)VEGF介導(dǎo)的牙囊細(xì)胞增殖的作用。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)果：VEGF在10~300ng/mL范圍內(nèi)能明顯提高人牙囊細(xì)胞的增殖水平和堿性磷酸酶活性（P<0.01）。VEGF處理組人牙囊細(xì)胞的增殖水平在孵育后1、3、5、7d均明顯高于對(duì)照組（P<0.01），而VEGF處理組人牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶活性在孵育后

9、3、5、7d明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。MAPK抑制劑能削弱VEGF介導(dǎo)的人牙囊細(xì)胞增殖。VEGF處理組人牙囊細(xì)胞的凋亡率略低于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：VEGF在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞的增殖，但無明顯抑制牙囊細(xì)胞凋亡的作用。MAPK信號(hào)通路是VEGF促進(jìn)人牙囊細(xì)胞增殖的一條可能途徑。VEGF還能促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶活性的升高，提示VEGF可能是促使牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞/

10、成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型分化的一種誘導(dǎo)因子。 第三部分：TNF-α、bFGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 目的：研究TNF-α、bFGF 對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF 表達(dá)的影響。 方法：選取生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細(xì)胞，采用RT-PCR 及ELISA 分別檢測TNF-α (bFGF)對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)及上清液中VEGF含量改變的濃度和時(shí)間效應(yīng)。 結(jié)果：①不同濃度TNF

11、-α作用1h 后, TNF-α處理組人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.05)，最佳效應(yīng)濃度為25ng/mL；不同濃度TNF-α作用12h 后，除1ng/mL 組外，其余各組上清液中VEGF 蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。②在時(shí)間效應(yīng)上，25ng/mLTNF-α作用1h 后人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)最強(qiáng)，然后隨時(shí)間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白含

12、量隨時(shí)間延長逐漸增加，但TNF-α處理組VEGF 蛋白含量高于對(duì)照組(P<0.05)。③不同濃度bFGF 作用6h 后, bFGF 處理組人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.05)，最佳效應(yīng)濃度為10ng/mL；不同濃度bFGF 作用12h后，bFGF 處理組上清液中VEGF 蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。④在時(shí)間效應(yīng)上，bFGF 作用1、3、6、12h 后人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)均較對(duì)照組顯著

13、增強(qiáng)(P<0.01)，其中bFGF 作用6h 后VEGF mRNA 表達(dá)最強(qiáng)；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白含量隨時(shí)間延長逐漸增加，但bFGF 處理組VEGF蛋白含量高于對(duì)照組(P<0.01)。 結(jié)論：TNF-α、bFGF 能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞合成并分泌VEGF。 第四部分：PKC、cAMP/PKA 信號(hào)通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)中的作用 目的：探討PKC、cAMP/PKA 信號(hào)通路在調(diào)

14、控體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)中的作用。 方法：選取生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細(xì)胞，采用Real-timePCR 分別檢測PKC 激動(dòng)劑（PMA）、PKC 非特異性抑制劑（G?6983）、PKC-α和γ特異性抑制劑（HBDDE）、PKC-β特異性抑制劑（LY333531）、cAMP/PKA激動(dòng)劑（dbcAMP）和抑制劑（KT5720）對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：PMA 組和PMA＋H

15、BDDE 組VEGF mRNA 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而PMA＋G?6983 組和PMA＋LY333531 組VEGF mRNA 的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無明顯差異（P>0.05）。dbcAMP 組VEGF mRNA 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而dbcAMP＋KT5720 組VEGF mRNA 的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論：PKC

16、、cAMP/PKA 信號(hào)通路均參與體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF 表達(dá)的調(diào)控，其中PKC 信號(hào)通路中參與調(diào)控的亞單位是PKC-β。 第五部分：VEGF 對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL 表達(dá)的影響 目的：探討VEGF 對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL 表達(dá)的影響。 方法：將生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細(xì)胞與25ng/mL VEGF 孵育不同時(shí)間后，采用RT-PCR 分別檢測OPG mRNA、RANK

17、L mRNA 表達(dá)的變化，采用ELISA 檢測上清液中OPG 蛋白含量變化。 結(jié)果：人牙囊細(xì)胞與VEGF 孵育6h 后RANKL mRNA 表達(dá)最強(qiáng)，與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其余各組RANKL mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。人牙囊細(xì)胞與VEGF 孵育1h 后OPG mRNA 表達(dá)水平開始下降，但與對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。孵育3h 后OPG

18、mRNA 表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以后OPG mRNA表達(dá)水平逐漸恢復(fù)，與對(duì)照組之間無明顯差異（P>0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中OPG 蛋白含量隨時(shí)間延長逐漸增加，但VEGF 處理組OPG 蛋白含量低于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論：VEGF 能夠抑制體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG 的表達(dá)，促進(jìn)其RANKL 的表達(dá)，通過RANKL-RANK-OPG 軸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和分化，參與牙齒萌出的調(diào)控