大麥TILLING群體的構建及其在抗病基因研究中的應用.pdf

1、定向誘導基因組局部突變技術（Targeting Induced Local Lesions In Genomes，TILLING)是在化學誘變和 PCR 定向篩選基礎上發(fā)展起來的檢測點突變的反向遺傳學研究方法，在多種重要農(nóng)作物上都有應用。本研究以大麥品種‘Tamalpais'為基礎材料經(jīng)化學誘變劑甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）處理獲得了大麥的TILLING突變?nèi)后w，并同時開發(fā)了基于芹菜內(nèi)切酶 CE

2、L I（Celery juice extract）的酶切篩選體系。通過篩選目的基因在該群體中的點突變個體，可進一步研究基因的功能。本研究針對大麥EDR1和 NPR1 進行突變體篩選，旨在初步揭示其在大麥水楊酸抗病途徑中的作用。主要研究結果如下：
　　 1.突變?nèi)后w的構建。實驗設置不同EMS濃度、處理時間及處理溫度等預備實驗，根據(jù)M1種子發(fā)芽率、出苗率和幼苗白化率等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)0.3％(v/v)EMS、10h和25℃是構建大麥突變

3、群體的合適條件。在此基礎上，創(chuàng)建了大麥品種 ‘Tamalpais'的TILLING群體，包括2154個 M2 株系，每4個株系DNA混合成池，共形成534個DNA池。
　　 2.芹菜內(nèi)切酶 CEL I的提取。CEL I內(nèi)切酶特異識別并切斷錯配堿基，是建立TILLING技術的關鍵組成。商業(yè)化CEL I價格昂貴，多數(shù)實驗室選擇獨立制備。實驗參照發(fā)表文獻，成功地從山東省泰安當?shù)胤N植的西芹中獲得具有活性的CEL I酶粗提物。
　

4、　 3.CEL I酶切體系的優(yōu)化。本實驗建立了基于CEL I酶切和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的篩選體系。實驗選用兩個攜帶單堿基差異的質粒為模板，獲得具有錯配堿基的PCR產(chǎn)物，通過比較CEL I酶使用量、酶切時間、酶切溫度和酶切緩沖液組成等因素對酶切效果的影響，確定合適的酶切體系。研究發(fā)現(xiàn)，使用適量的CEL I酶（不同制備需要獨立優(yōu)化），在1/10體積的酶切緩沖液（20 mM HEPES pH7.5，10mM KCl和3mM MgCl2

5、）中,45℃條件下酶切30min可獲得理想的酶切效果。
　　 4.水楊酸抗病途徑相關基因的突變體篩選。EDR1（GenBank：AF305913）和 NPR1（GenBank：ATU76707）是擬南芥水楊酸抗病信號通路相關的兩個關鍵基因；大麥中存在EDR1和NPR1的同源基因（EDR1：AF305912；NPR1：AM050559）；對公共數(shù)據(jù)庫進行分析，分別獲得了大麥同源基因的完整信息。利用兩個同源基因設計PCR引物，并對

6、本研究所創(chuàng)建的TILLING群體進行了篩選；結果共獲得5個突變單株，其中EDR1基因突變體3個，NPR1基因突變體2個。序列分析表明,2個突變發(fā)生在內(nèi)含子、1個NPR1基因的同義突變、2個EDR1基因的錯義突變（His351Tyr和Pro556Ser）。
　　 本研究創(chuàng)建了大麥品種 ‘Tamalpais'的TILLING篩選群體，并成功用于水楊酸信號通路相關基因EDR1和NPR1突變體的篩選。本研究搭建了開展大麥反向遺傳學研究的