免疫基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和評估及在豬抗病育種高通量數(shù)據(jù)中的初步應用.pdf

1、免疫系統(tǒng)的正常工作對于機體健康具有重要作用，免疫系統(tǒng)的失職、失察或者過激反應都會引發(fā)感染或者其他疾病。由于免疫系統(tǒng)組成和反應的復雜性，同時受限于生物實驗技術(shù)和實驗結(jié)果分析方法，使得復雜疾病的診斷、解釋和動物育種有效分子標記的開發(fā)成為生物醫(yī)學和動物育種的重點和難點。各種高通量生物技術(shù)的發(fā)展，特別是以蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為代表的生物網(wǎng)絡(luò)顯示了很好的基因間的復雜作用關(guān)系，為復雜疾病和動物抗病育種提供了大量可靠的數(shù)據(jù)支持。目前，高通量數(shù)

2、據(jù)的獲取不再困難，研究人員面臨的挑戰(zhàn)是如何在生物醫(yī)學和動物遺傳育種研究過程中運用這些數(shù)據(jù)。
　　 本研究旨在發(fā)展高通量的免疫基因組學分析平臺和方法，在哺乳動物全或近全免疫基因組數(shù)據(jù)的收集、整理的基礎(chǔ)上，通過全或近全免疫基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與評估，深入解析了動物免疫基因組的特點，并將免疫基因組/免疫網(wǎng)絡(luò)作為工具，初步運用于表達譜和GWAS。主要結(jié)果和發(fā)現(xiàn)如下:
　　 1.全或近全免疫基因組數(shù)據(jù)的收集、免疫基因網(wǎng)絡(luò)的建立與評估

3、r>　　 原始數(shù)據(jù)主要來源于6個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(BioGRID、InAct、HPRD、Innatedb、Reactome、MINT)和4個基因通路數(shù)據(jù)庫(NCI/Nature pathway interaction、IMID、HumanCyc、Cancer cell map)。通過SIF格式進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、統(tǒng)一與整合，同時利用功能互作網(wǎng)絡(luò)（Functional Interaction Network）對數(shù)據(jù)整合的有效性進行評估和再次整合，

4、最后建立了一個包含16219個基因和984215個互作對的全基因互作網(wǎng)絡(luò)。
　　 在此基礎(chǔ)上，從4個免疫基因數(shù)據(jù)庫(Immport，IRIS，Immtmome Database andInnatedb curated genes)和相關(guān)文獻中對免疫基因做了系統(tǒng)的收集和整理，共得到了8806個免疫功能相關(guān)基因(immune functional related genes)。
　　 利用免疫功能相關(guān)基因，從全基因互作網(wǎng)絡(luò)(

5、whole genome interadtion network)中釣取免疫基因相關(guān)的互作信息。利用該策略，我們分別得到了開放式免疫基因網(wǎng)絡(luò)（open immune gene network）與封閉式免疫基因網(wǎng)絡(luò)(closed immune gene network)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在開放式免疫基因網(wǎng)絡(luò)中，6816個免疫基因與15727個基因存在817419個互作對，而封閉式免疫基因網(wǎng)絡(luò)包含6732個免疫功能基因和375472個免疫基因互作

6、對。利用免疫基因子集覆蓋度方法對免疫基因網(wǎng)絡(luò)進行評估。發(fā)現(xiàn)在免疫基因數(shù)目較少的情況下，免疫基因數(shù)目對免疫基因網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的全面性影響較小而對網(wǎng)絡(luò)中邊的豐富性影響較大。當免疫基因個數(shù)達到一定數(shù)目之后，再增加免疫基因?qū)τ诿庖呔W(wǎng)絡(luò)節(jié)點和邊的全面性影響都非常小。同時還發(fā)現(xiàn)某些免疫基因子集(immunegene subsets)的影響遠遠大于其他免疫基因子集對于整個免疫網(wǎng)絡(luò)的組成的影響。
　　 我們進一步對封閉式免疫基因網(wǎng)絡(luò)的拓撲學參數(shù)(to

7、pological parameters)進行了估計，發(fā)現(xiàn)在6732個免疫基因中，有1740個免疫基因在網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)中的連接數(shù)目超過100，其中有67個免疫與其他免疫基因之間的連接數(shù)超過1000，免疫網(wǎng)絡(luò)中約有1％的基因成為“超級連接”節(jié)點。
　　 2.免疫基因組數(shù)據(jù)在基因表達譜芯片分析中的應用
　　 我室建立了用于免疫性狀研究的杜洛克-二花臉F2分離群體，所測定免疫性狀包括在PolyI∶C刺激前后，外周血細胞因子水平和

8、T淋巴細胞比例（數(shù)目）變化。我們利用免疫基因組數(shù)據(jù)，對PolyI∶C刺激前后，IFN-a水平兩尾個體的免疫基因表達譜開展了差異表達基因與基因集富集分析(GSEA)分析。
　　 首先，我們對IFN-a應答高組(High group)（23對）和低組(Low group)（24對）的全血表達譜芯片(whole blood transcriptome)進行了差異表達基因分析(differentialexpression gene an

9、alysis)（PValue≤0.01，adj.P.Val≤0.05，LogFC≥1）。在高組中得到了344個下調(diào)表達基因（370探針）和357上調(diào)表達基因（450探針）。在低組中一共得到386個下調(diào)表達基因(426探針)和251個上調(diào)表達基因（306探針）。有5個基因ETV6，DMD，SMARCC1，AKAP9和SDHB在其中一組或兩組中存在差異表達探針(differential expression probe)。差異表達基因的GO

10、分析顯示兩組中的上調(diào)表達基因都集中在免疫抵抗、炎癥、損傷抵抗過程(defense response，response tovirus，inflammatory response);細胞凋亡、程序性死亡調(diào)控過程(regulation of apoptosis，regulation of programmed cell death，regulation of cell death);下調(diào)表達基因都集中在血細胞發(fā)生和淋巴細胞活化與分化(cel

11、l proliferation，T cell activation，lymphocyteactivation，lymphocyte differentiation)。高組在免疫抵抗、炎癥、損傷抵抗過程(defenseresponse，response to virus，inflammatory response)比低組更加強烈，低組可能存在一個額外的蛋白激酶（regulation of kinase activity）上調(diào)基因群。

12、>　　 其次，基于基因集富集分析(GSEA)的基因通路分析，在兩組內(nèi)都未能得到差異顯著的基因通路。通過比較高組和低組差異最明顯的前10條基因通路發(fā)現(xiàn)，高組和低組上調(diào)基因通路中前10條通路7條都集中在干擾素相關(guān)(interferon relatedpathways)通路，下調(diào)基因通路卻顯示很大的不同。High組中的基因通路主要涉及的有蛋白質(zhì)代謝(Reactome metabolism of proteins)、不飽和脂肪酸代謝(bios

13、ynthesis ofunsaturated fatty acids)、TCA循環(huán)的電子轉(zhuǎn)移(TCA cycle and respiratory electrontransport)以及T細胞受體通路(TCR pathway)。Low組中的基因通路涉及的生物學過程比較分散，蛋白質(zhì)代謝中的蛋白質(zhì)折疊(protein folding)、DNA復制(DNAreplication)以及血液系統(tǒng)疾病通路(Hematological Disease

14、 pathways)，包括鐮刀形紅細胞病以及急性T淋巴細胞白血病的復發(fā)預后(Jison sickle cell disease，Chiaretti TALL relapse prognosis)。
　　 3.免疫基因網(wǎng)絡(luò)在GWAS結(jié)果注釋中的應用
　　 用GAPPIT軟件對PolyI∶C刺激前、后的外周血T淋巴細胞亞型（比例）數(shù)目和CD4∶CD8 T細胞比率進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)。CD4 T細胞數(shù)目和CD4∶

15、CD8 T細胞比率共同鎖定到了豬的5號染色體一段大約8.4M的區(qū)域，在最新的基因組注釋版本中這段區(qū)域中包括153個基因。為了進一步縮小候選基因范圍，我們將鎖定區(qū)域內(nèi)的基因和免疫基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)合分別建立了CD4 T細胞表型包括131個基因和18022個互作和CD4∶CD8 T細胞比率包括126個基因和16235個互作的“致因網(wǎng)絡(luò)”，并將“致因網(wǎng)絡(luò)”用于候選基因推斷。通過對“致因網(wǎng)絡(luò)”拓撲學參數(shù)估計結(jié)果，綜合判斷ETV6、GAPDH基因內(nèi)的SN

16、P或與ETV6，GAPDH基因SNP緊密連鎖的位點最可能為致因位點。
　　 本文通過公共數(shù)據(jù)庫整合和文獻挖掘的方法建立了動物免疫基因組學數(shù)字化分析平臺。通過對基因網(wǎng)絡(luò)的評估從某種方面說明了免疫基因網(wǎng)絡(luò)的全面性，同時發(fā)現(xiàn)了免疫基因網(wǎng)絡(luò)的拓撲學結(jié)構(gòu)特征。將建立的免疫基因網(wǎng)絡(luò)應用到了兩個我室的第一手豬抗病育種高通量表達譜芯片和SNP芯片的分析。免疫基因網(wǎng)絡(luò)分析為大樣本表達譜芯片在差異基因表達分析和基因通路分析后得不到一致性結(jié)果的情況下