花椰菜抗黑腐病相關基因的克隆及其在抗病育種中的應用.pdf

1、花椰菜是十字花科蕓薹屬甘藍種中以花球為產(chǎn)品的一個變種，具有重要的經(jīng)濟價值。但在栽培過程中，黑腐病的大流行會使蔬菜品質(zhì)嚴重下降，造成大幅度減產(chǎn)，使得針對該病成因及預防的研究成為科學家關注的熱點。但是目前對植物抗黑腐病的研究進展主要集中在該病的遺傳規(guī)律，以及對致病菌侵染的應答模式等方面，而在分子水平上對于抗黑腐病基因的研究卻很少。本論文通過篩選抗黑腐病基因相關分子標記，同時結(jié)合電子克隆技術尋找候選的抗病基因，該研究對推進防治黑腐病的進程具有

2、重要理論意義和應用價值。本文以花椰菜抗感黑腐病一對近等基因系為實驗材料，在抗黑腐病基因篩選的研究中，首次將ISSR分子標記與電子克隆技術相結(jié)合，獲得一個與花椰菜抗黑腐病相關候選基因BRR-C，然后采用Southern雜交技術證明了BRR-C在抗、感花椰菜黑腐病材料中的多態(tài)性。進一步將RT-PCR技術與RQ-PCR技術相結(jié)合，相應于菌體脅迫前后以及時間長度的變化，在抗、感花椰菜黑腐病材料中觀察到與預期相符的BRR-C表達趨勢，從而推測BR

3、R-C很可能參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機制，并對BRR-C可能參與的抗病機制進行了探討。同時根據(jù)ISSR分子標記及BRR-C序列設計了三對SCAR標記引物，這對分子標記技術輔助抗性育種的應用具有重要意義。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴應用ISSR分子標記技術，從近等位基因系材料中篩選得到了兩條差異明顯且重復性好的條帶，即ISSR21200，ISSR17800。經(jīng)過克隆測序后分析發(fā)現(xiàn)，ISSR17800與Brassica napus v

4、at.napus的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AJ245479)具有93％的同源性；而ISSR21200與擬南芥中的一段EST序列(AK228713，hypothetical protein)有85％的同源性。
　　 ⑵利用分子標記ISSR21200作為種子序列，通過電子克隆技術獲得抗黑腐病候選基因BRR(black rot resistance candidate genes)。隨后依據(jù)BRR設計特異引物，在花椰菜基因組中分離到1

5、條候選基因BRR-C(black rot resistance candidategenes of cauliflower)，經(jīng)過克隆測序后分析發(fā)現(xiàn)，該序列全長2204bp，包含2個外顯子和2個內(nèi)含子，共編碼484個氨基酸，與擬南芥逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶基因存在高同源性。
　　 ⑶采用Southern雜交技術，將BRR-C與抗、感花椰菜黑腐病基因組進行雜交，結(jié)果表明BRR-C在抗、感病性材料中存在明顯多態(tài)性，并且在花椰菜基因組中

6、以低拷貝形式存在。
　　 ⑷依據(jù)BRR-C含有的保守序列設計一對特異引物，進行RT-PCR分析，結(jié)果表明BRR-C在脅迫條件下表達豐度提高。隨后以不同時間段XCC脅迫的近等位基因系為材料，進行RQ-PCR(real-time-quantimtive PCR)分析，結(jié)果表明花椰菜中BRR-C的表達確實受到XCC的誘導。因此，我們認為BRR-C參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機制，這為進一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候選基因。