水稻ONAC家族基因重疊表達(dá)特性及其在抗病抗逆中的功能研究.pdf

1、植物在生長發(fā)育的過程中，經(jīng)常會受到干旱、高鹽、低溫、病原菌等各種非生物和生物脅迫的影響。這些脅迫通常會造成植物細(xì)胞的損傷，進(jìn)而嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和作物產(chǎn)量。在長期的進(jìn)化過程中，植物形成了一系列生理、生化、代謝及防御機(jī)制，以適應(yīng)和抵御各種生物和非生物逆境。在眾多的適應(yīng)和抗逆機(jī)制中，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物適應(yīng)環(huán)境和抵御逆境脅迫中起重要作用。NAC(NAM/ATAF/CUC)家族基因是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，存在于多種植物中，其共同特點(diǎn)

2、是在N端含有一段高度保守、約由150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，而C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物生長發(fā)育的調(diào)控、而且在植物抗病抗逆反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。本研究系統(tǒng)分析了ONAC家族基因?qū)ι锱c非生物脅迫的響應(yīng)、并分離克隆21個抗病抗逆相關(guān)的ONAC基因。在此基礎(chǔ)上，研究了這21個ONAC基因在抗病信號分子處理、水稻-稻瘟菌和水稻-白葉枯病菌互作中的表達(dá)模式，以及初步分析了部分基因的生化特性和在抗病抗

3、逆中的功能，旨在發(fā)現(xiàn)潛在的抗病抗逆脅迫相關(guān)的基因，為基因工程提高水稻抗病抗逆性能提供理論基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 本研究利用水稻基因芯片公共數(shù)據(jù)庫[Rice Oligonucleotide Array Database(ROAD)(http://www.ricearray.org/)]，對多種生物[稻瘟病(Magnaporthe grisea)、寄生植物獨(dú)腳金（Striga hermonthica）、水稻條紋病毒

4、(Rice stripe virus，RSV)、水稻白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)、水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xoc)]與非生物（高鹽、干旱、低溫）脅迫下ONAC家族基因的響應(yīng)進(jìn)行分析，并選擇30個ONAC基因?qū)Σ糠置{迫因子下的響應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家族基因有63個ONAC基因?qū)Χ喾N脅迫因子有重疊表達(dá)的特性，在這些重疊表達(dá)的基因中，

5、多數(shù)基因在高鹽、干旱、低溫、稻瘟病、寄生植物獨(dú)腳金、水稻條紋病毒誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。對于非生物脅迫，38個ONAC基因重疊表達(dá)于任意兩種脅迫條件，且選擇的30個ONAC基因中有16個受脫落酸(Abscisic acid，ABA)誘導(dǎo)表達(dá);而對于生物脅迫，有65個基因重疊表達(dá)于任意兩種生物脅迫因子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明這些重疊表達(dá)的基因分布于ONAC家族的10個亞組[OsNAC7(SND)、ONAC11(NAC1)、SNACⅠ、SNACⅡ(NAM

6、/CUC3)、SNACⅢ(TIP)、SNACⅣ(ANAC34)、ONAC079(ONAC6)、ONAC012(ONAC7)、ONAC135(ONAC3)和ONAC100(ONAC2)]，同源搜索發(fā)現(xiàn)在該家族有16組基因高度同源。ONAC基因?qū)Χ喾N脅迫因子的重疊表達(dá)特性及其基因間的高度同源性，預(yù)示著ONAC基因的功能多效性和相似性。
　　 選擇克隆了21個水稻抗病抗逆相關(guān)候選ONAC基因，研究了這些ONAC基因在抗病信號分子處理、

7、水稻-稻瘟菌以及水稻-白葉枯病菌互作中的表達(dá)模式。結(jié)果表明分離獲得的21個抗病抗逆相關(guān)ONAC基因中，除了ONAC058和ONAC066，多數(shù)ONAC基因的表達(dá)能被水楊酸(Salicylic acid, SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、ACC(Ethylene，ET)多個抗病信號分子所誘導(dǎo)，但表達(dá)模式在不同抗病信號分子處理后不盡相同，相對于SA，多數(shù)ONAC基因?qū)CC(ET)或JA的響應(yīng)程度較強(qiáng)。其中，12個ONA

8、C基因（OsNAC8、ONAC016、ONAC022、ONAC023、ONAC049、ONAC054、ONAC061、ONAC063、ONAC075、ONAC095、ONAC122和ONAC131、）的表達(dá)可以被ACC(ET)強(qiáng)烈誘導(dǎo)，6個ONAC基因（SNAC1、OsNAC4、OsNAC5、OsNAC6、ONAC103和ONAC121）表達(dá)受JA強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這些結(jié)果表明這18個抗病抗逆相關(guān)ONAC基因是通過JA/ET信號途徑或通過JA/

9、ET與SA信號途徑參與水稻的抗病反應(yīng)。在水稻-稻瘟菌、水稻-白葉枯病菌互作模式下，11個ONAC(ONAC022、 ONAC023、 ONAC049、 ONAC054、 ONAC061、 ONAC075、 ONAC095、ONAC103、ONAC121、ONAC122和ONAC131)基因在水稻-稻瘟病菌、水稻-白葉枯病菌的非親和性互作中特異性地誘導(dǎo)表達(dá)，因而可能與水稻抗稻瘟病、水稻白葉枯病反應(yīng)的激活有關(guān)。此外，3個ONAC基因（OsN

10、AC6、OsNAC8、ONAC063）在水稻-稻瘟病菌的非親和性互作中特異性地誘導(dǎo)表達(dá)，而在水稻-白葉枯病菌的非親和性互作中表達(dá)下調(diào)，這3個基因可能與抗水稻稻瘟病激活有關(guān)，且與抗水稻白葉枯病的抑制有關(guān)。4個ONAC基因（OsNAC3、OsNAC4、ONAC016和ONAC058）在水稻-白葉枯病菌非親和性互作中上調(diào)表達(dá)，可能參與水稻對白葉枯抗病的激活有關(guān)。
　　 選擇研究5個ONAC基因（ONAC023、ONAC063、ONAC

11、095、ONAC122、ONAC131）的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)這5個基因編碼的蛋白都能定位于細(xì)胞核，且都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)初步對一些分離的ONAC基因的抗病功能進(jìn)行初步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)5個ONAC基因(ONAC023、ONAC095、ONAC122、ONAC131和OsNAC6)分別沉默后，水稻抗稻瘟病害表現(xiàn)出感病性的增加，且一些抗病相關(guān)的基因（Oseds1、OsPAD4、O

12、sLOX、 OsPR3、OsPR1a、Os WRKY45、OsJamyb和OsNH1/NPR1也不同程度的表達(dá)下調(diào)，表明這5個ONAC基因通過直接或間接調(diào)控這些抗病相關(guān)的基因參與水稻對稻瘟病抗性。另外，ONAC023和ONAC095兩個基因沉默后，對白葉枯病的抗病性下降，表明這兩個基因可能在白葉枯抗病中具有正向調(diào)控的作用。
　　 為了深入的探討ONAC基因在抗病抗逆反應(yīng)中的功能，構(gòu)建了多數(shù)克隆的ONAC基因的超表達(dá)載體和SRDX