水稻中激素和肌醇磷酸代謝相關(guān)基因的抗逆功能研究.pdf

1、干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中最重要的限制因子，植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)伴隨著對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育過程很多基因的調(diào)。水稻是世界最重要的糧食作物之一，維持正常的發(fā)育過程和產(chǎn)量需要很好的氣候條件，然而缺乏的淡水資源和極端的溫度經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量。因此提高作物對(duì)非生物逆境的抗性是我們亟待解決的事情，在過去的幾十年中，人們努力尋找可以提高作物抗逆性的基因，很多研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)或抑制表達(dá)一些基因可以顯著提高作物的抗逆性。

2、>　　 Abscisic acid(ABA)，乙烯，生長(zhǎng)素和肌醇三磷酸IP3通過復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過程，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答環(huán)境信號(hào)。然而這些信號(hào)分子與非生物逆境之間的關(guān)系還有很多未知的地方。為了在水稻中鑒定一些和非生物逆境相關(guān)的基因，我們篩選了水稻T-DNA插入突變體及超表達(dá)一些非生物逆境誘導(dǎo)的候選基因。我們對(duì)兩個(gè)個(gè)干旱敏感的突變體(dsm2，dsm3)和一個(gè)抗旱突變體(osetol1)的基因進(jìn)行了深入功能分析。此外，我們還基于

3、OsGH3-2超表達(dá)水稻干旱敏感表型分析了該基因的抗逆功能。主要結(jié)果如下:
　　 干旱敏感的突變體dsm2由于T-DNA插入失活的是一個(gè)編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因，該基因的轉(zhuǎn)錄水平在微管組織及孕穗期葉片中表達(dá)量較高，且受干旱、高鹽及紫外線處理誘導(dǎo)上升表達(dá)，該基因編碼一個(gè)葉綠體蛋白催化由β-胡蘿卜素生成玉米黃質(zhì)的反應(yīng)，此過程也是ABA合成途徑中的重要步驟之一。在干旱脅迫條件下，突變體對(duì)干旱非常敏感主要表現(xiàn)在失水速率快，相對(duì)含水量

4、較低，光合速率、花粉育性、結(jié)實(shí)率、生物量均顯著低于對(duì)照，而丙二醛含量及氣孔開放率顯著高于對(duì)照，是由于突變體在干旱脅迫條件下，ABA含量顯著下降。此外突變體對(duì)氧化脅迫處理如紫外線(UV)及甲基紫精(MV)表現(xiàn)敏感，葉綠體熒光參數(shù)測(cè)定表明突變體光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)及非光化學(xué)猝滅(NPQ)能力較野生型對(duì)照顯著降低，表明在突變體中光合系統(tǒng)Ⅱ中極易出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象，高效液相色譜結(jié)果表明突變體中玉米黃質(zhì)含量下降致使參與高光保護(hù)及消除活性氧的葉黃

5、質(zhì)循環(huán)處于較低的水平，導(dǎo)致dsm2突變體對(duì)氧化脅迫敏感的表型。DSM2超量表達(dá)的水稻植株表現(xiàn)出對(duì)干旱及氧化脅迫較強(qiáng)的抵抗能力，以及較強(qiáng)的葉黃質(zhì)循環(huán)水平和光保護(hù)能力，主要是由于較高的葉黃質(zhì)循環(huán)水平。此外突變體和超表達(dá)植株在干旱脅迫前后一些ABA合成和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因，及氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)量有顯著差異。DSM2同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)水稻基因組中共有三個(gè)同源基因，但由于該家族基因在進(jìn)化過程中啟動(dòng)子區(qū)段出現(xiàn)了不同的選擇，DSM2基因啟動(dòng)子區(qū)域富集逆

6、境相關(guān)的順式作用元件，其受干旱和UV誘導(dǎo)最強(qiáng)，與另外兩個(gè)同源基因表現(xiàn)出不同的逆境誘導(dǎo)表達(dá)模式和組織特異性表達(dá)模式。
　　 干旱敏感的突變體dsm3由于T-DNA插入失活的是一個(gè)編碼肌醇1，3，4三磷酸-5/6激酶的基因OslTPK2/DSM3，該基因的轉(zhuǎn)錄水平在莖節(jié)及孕穗期葉片中表達(dá)量較高，在幼根幼穗中表達(dá)較低，且受干旱、高鹽及ABA處理誘導(dǎo)上升表達(dá)，該基因編碼一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白催化由肌醇三磷酸(IP3)生成肌醇四磷酸(IP4)的反

7、應(yīng)，此過程也是肌醇多磷酸代謝途徑中的重要步驟之一。在干旱脅迫條件下，突變體dsm3對(duì)干旱非常敏感主要表現(xiàn)在脯氨酸、可溶性糖、花粉育性、結(jié)實(shí)率、生物量均顯著低于對(duì)照，而氧化脅迫產(chǎn)物丙二醛含量顯著高于對(duì)照表明突變體的抗氧化能力顯著降低，可能是由于突變體在干旱脅迫條件下，信號(hào)分子肌醇三磷酸代謝紊亂，導(dǎo)致干旱信號(hào)的傳導(dǎo)不正常。構(gòu)建人造小RNA抑制內(nèi)源DSM3基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因陽性植株在干旱與高鹽脅迫下與突變體表型一致。然而，DSM3基因的超量表

8、達(dá)植株同樣表現(xiàn)出對(duì)干旱和高鹽的敏感性，而超表達(dá)植株非逆境相關(guān)生理指標(biāo)也表現(xiàn)出與突變體相似的表型。高效液相色譜結(jié)果表明超表達(dá)植株中二級(jí)信使肌醇三磷酸(IP3)含量下降致使，突變體對(duì)干旱和高鹽敏感。此外，我們檢測(cè)了突變體和超表達(dá)植株在干旱脅迫前后一些非生物逆境相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)量有顯著差異，表明肌醇三磷酸(IP3)含量的改變導(dǎo)致氧化損傷。DSM3同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)水稻基因組中共有6個(gè)同源基因，但由于該家族基因基因結(jié)構(gòu)在基因家族

9、形成的過程中出現(xiàn)了不同的選擇，導(dǎo)致該家族成員表現(xiàn)出不同的逆境誘導(dǎo)表達(dá)模式和組織特異性表達(dá)模式。
　　 osetol1是一個(gè)抗旱但對(duì)澇害敏感突變體。該突變是由于T-DNA插入一個(gè)編碼含有BTB結(jié)構(gòu)域的E3連接酶基因而失活。該基因在我們突變體庫里有兩個(gè)等位突變體命名為osetol1-1和osetol1-2，該突變體表現(xiàn)為孕穗期在干旱脅迫條件下較高的結(jié)實(shí)率和生物量，但在澇脅迫條件下表現(xiàn)出較慢的生長(zhǎng)速度。在水稻中超表達(dá)OsETOL1表現(xiàn)

10、出與突變體相反的表型。對(duì)OsETOL1的組織表達(dá)譜和非生物逆境表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，OsETOL1主要在成熟組織表達(dá)，可以被干旱和澇強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而且表現(xiàn)出與該家族其余2個(gè)成員OsETOL2和OsETOL3不同的表達(dá)模式?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)OsETOL1主要影響淀粉代謝和糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，說明OsETOL1可能是能量代謝的調(diào)控子。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)OsETOL1可以與乙烯合成關(guān)鍵酶OsACS2互作，互作位置在細(xì)胞質(zhì)。此外，我們?cè)?/p>

11、突變體庫中找到乙烯合成基因OsACS2的突變體osacs2。色譜分析表明在osacs2突變體和OsETOL1超表達(dá)水稻中ACC和乙烯含量顯著下降。此外，10μM外源ACC處理可以恢復(fù)osacs2突變體中和OsETOL1超表達(dá)水稻中因ACC缺陷導(dǎo)致的澇脅迫下生長(zhǎng)較慢的表型。說明OsETOL1負(fù)調(diào)控乙烯合成的機(jī)制在水稻和擬南芥中是保守的，但遺傳和序列分析分析發(fā)現(xiàn)ETOL家族基因在水稻和擬南芥中既有功能的相似性同時(shí)也存在一定的差異。
　

12、　 OsGH3-2在非生物逆境抗性中也發(fā)揮重要功能。OsGH3-2編碼吲哚乙酸氨基化合成酶，研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控ABA的合成和非生物逆境的抗性，OsGH3-2基因受干旱誘導(dǎo)上升表達(dá)，低溫抑制OsGH3-2的表達(dá)。OsGH3-2超表達(dá)水稻表現(xiàn)出顯著的形態(tài)改變，如植株矮小、葉夾角增大、更小的劍葉、穗和節(jié)。此外，OsGH3-2超表達(dá)水稻還表現(xiàn)出冠根和根毛數(shù)目顯著降低。液相色譜分析發(fā)現(xiàn)OsGH3-2超表達(dá)水稻中a-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素顯著下降，

13、質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)游離IAA和ABA含量顯著下降。OsGH3-2超表達(dá)水稻在干旱脅迫條件下增加氣孔的開度和水分散失。然而，OsGH3-2超表達(dá)水稻表現(xiàn)出抵抗低溫脅迫和抗氧化損傷的能力。可能是由于OsGH3-2超表達(dá)減少了游離IAA的含量，減輕了氧化損傷和低溫下細(xì)胞膜的透性。實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)ABA合成和一些非生物逆境相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。但是抑制OsGH3-2基因的表達(dá)沒有導(dǎo)致株型的改變，IAA、ABA含量和對(duì)非生物逆境的抗性也沒有

14、顯著差異，可能是由于OsGH3家族基因功能的冗余，對(duì)OsGH3家族基因表達(dá)譜和序列分析也發(fā)現(xiàn)該家族基因既存在功能的冗余性也表現(xiàn)出一定的特異性。
　　 ABA缺陷型突變體phs1 phs2 phs3 phs4和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片白化，體內(nèi)葉綠體及內(nèi)囊體膜發(fā)育畸形，我們用液相色譜儀-質(zhì)譜檢測(cè)了，這些植株體內(nèi)的類胡蘿卜素、ABA和IAA含量發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素和ABA顯著下降，體內(nèi)IAA的合成也顯著降低，在干旱脅迫條件下ABA缺

15、陷型植株保持比對(duì)照更高的氣孔開放率，在苗期干旱脅迫條件下phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫顯著快于對(duì)照，嚴(yán)重干旱脅迫恢復(fù)后，phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的成活率顯著低于對(duì)照，表明phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱敏感，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，依賴于ABA信號(hào)的某些干旱應(yīng)答基因如編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子和LEA蛋白的一些基因，在干旱脅迫狀態(tài)下的phs3-1和PDS

16、-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中誘導(dǎo)的強(qiáng)度顯著低于陰性對(duì)照。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)，phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫表現(xiàn)出較高的抗性，這一點(diǎn)可能是由于phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源IAA含量顯著下降，減弱了低溫脅迫下植物膜系統(tǒng)的氧化損傷，并增強(qiáng)了低溫脅迫下細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。為了確信ABA缺陷型植株體內(nèi)IAA含量的下降是由內(nèi)源ABA含量下降造成，我們用外源施加不同濃度的ABA合成抑制劑氟啶酮(fluridone)，抑制內(nèi)源ABA