溫度和魚(yú)油含量對(duì)金錢(qián)魚(yú)卵巢發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、金錢(qián)魚(yú)（Scatophagus argus）味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，在我國(guó)沿海及內(nèi)地經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)城市以及臺(tái)、港、澳、韓國(guó)、日本、泰國(guó)等地有廣闊的市場(chǎng)，目前市場(chǎng)價(jià)格達(dá)100～200元/公斤。迄今，金錢(qián)魚(yú)大部分養(yǎng)殖種苗仍然來(lái)自野生資源，數(shù)量有限且呈逐年減少之勢(shì)，因此對(duì)其人工種苗的需求量日益加大。
　　本研究以金錢(qián)魚(yú)為研究對(duì)象，用不同溫度（23℃、26℃、29℃）和魚(yú)油梯度（0、2％和6%）分別處理2齡雌性金錢(qián)魚(yú)6周和8周，采用RT-PCR和

2、RACE法，克隆金錢(qián)魚(yú)叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Foxl2）、腦型芳香化酶基因（Cyp19a1b）cDNA全長(zhǎng)以及卵黃蛋白原（Vtg）cDNA片段，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了兩種處理對(duì)Foxl2在卵巢、Cyp19a1b在腦垂體以及Vtg在肝臟和卵巢中mRNA表達(dá)的影響；同時(shí)，分別應(yīng)用比色法、放射免疫測(cè)定法（RIA）以及連續(xù)組織切片技術(shù)，檢測(cè)了兩種處理對(duì)卵巢發(fā)育過(guò)程中血清中蛋白磷（SPP）、蛋白鈣(SPC)、性類(lèi)固醇激素（雌二醇：E2,睪酮：T）

3、以及組織學(xué)變化的影響，為解決金錢(qián)魚(yú)人工繁育問(wèn)題提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　1.溫度和魚(yú)油含量對(duì)金錢(qián)魚(yú)卵巢組織學(xué)變化的影響
　　溫度處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束（6周）時(shí)，23℃和26℃組金錢(qián)魚(yú)卵巢中出現(xiàn)Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞，而29℃組仍和實(shí)驗(yàn)前一樣，卵巢內(nèi)充滿(mǎn)Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞；魚(yú)油處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（8周），6%魚(yú)油組金錢(qián)魚(yú)卵巢中出現(xiàn)Ⅳ時(shí)相中后期卵母細(xì)胞，2%魚(yú)油組卵巢中Ⅲ和Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞并存，而對(duì)照組卵巢中主要為Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞。
　　2.

4、溫度和魚(yú)油含量對(duì)血清性類(lèi)固醇激素及生化指標(biāo)的影響
　　溫度對(duì)血清中T水平無(wú)顯著影響；3周時(shí)，23℃和26℃組血清中E2水平略高于29℃組，但6周時(shí)兩者顯著大于29℃組（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)期間23℃和26℃組血清中SPP含量顯著高于29℃組（P<0.05），而SPC含量?jī)H23℃組顯著高于29℃組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)期間2%和6%魚(yú)油組的E2逐漸升高，且在8周時(shí)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組E2無(wú)顯著變化；對(duì)照組和魚(yú)油

5、投喂組SPP值均逐漸上升，且8周時(shí)6%魚(yú)油組的SPP值顯著高于對(duì)照組和2%魚(yú)油組（P<0.05）；各魚(yú)油處理組SPC和T水平在實(shí)驗(yàn)中期（4周）達(dá)到峰值，此后下降。
　　3.溫度和魚(yú)油含量對(duì)金錢(qián)魚(yú)Foxl2基因表達(dá)的影響
　　金錢(qián)魚(yú)Foxl2 cDNA全長(zhǎng)2024bp，其開(kāi)放閱讀框（ORF）包含918bp，編碼305個(gè)氨基酸，包括104個(gè)氨基酸組成的FH結(jié)構(gòu)域（FH-domain），5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）有226bp，

6、3'-UTR（不包括poly（A））有848 bp，推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為34.365kDa。序列分析及分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，金錢(qián)魚(yú)Foxl2與其它非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物一樣，缺少14個(gè)丙氨酸組成的聚丙氨酸重復(fù)區(qū)和甘氨酸-脯氨酸重復(fù)區(qū)，其氨基酸序列與網(wǎng)紋石斑魚(yú)同源性最高，為98.4%，同源性分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和生化特征分類(lèi)的結(jié)果相一致。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，23℃和26℃組金錢(qián)魚(yú)卵巢中Foxl2 mR

7、NA的表達(dá)量均逐漸增加，且26℃組的表達(dá)量顯著高于23℃組（P<0.05），而29℃組表達(dá)量先略增加再回到實(shí)驗(yàn)前水平；魚(yú)油處理實(shí)驗(yàn)顯示，2%和6%魚(yú)油組金錢(qián)魚(yú)卵巢中Foxl2 mRNA的表達(dá)量均逐漸增加，但兩組間無(wú)顯著差異（P>0.05），對(duì)照組金錢(qián)魚(yú)卵巢中Foxl2 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著變化。
　　4.溫度和魚(yú)油含量對(duì)金錢(qián)魚(yú)腦型芳香化酶Cyp19a1b基因表達(dá)的影響
　　金錢(qián)魚(yú)Cyp19a1b cDNA全長(zhǎng)2409bp，

8、其開(kāi)放閱讀框（ORF）包含1506bp，編碼501個(gè)氨基酸，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）有164bp，3'-UTR（不包括 poly（A））有712 bp，推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為56.697kDa。序列分析及分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明：金錢(qián)魚(yú)Cyp19a1b氨基酸序列與黃錫鯛和舌齒鱸Cyp19a1b同源性較高，分別為86.2%、86.5%，但與魚(yú)性腺芳香化酶（Cyp19a1a）同源性低于63.5%，同源性分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和生化特征分

9、類(lèi)的結(jié)果相一致。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，26℃和29℃組金錢(qián)魚(yú)腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量均逐漸降低，但29℃組顯著低于26℃組（P<0.05），而23℃組在6周時(shí)則顯著高于26℃和29℃組（P<0.05），約為26℃組表達(dá)量的2倍；2%和6%魚(yú)油組金錢(qián)魚(yú)腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)量逐漸降低，但魚(yú)油對(duì)金錢(qián)魚(yú)腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著影響（P>0.05）。<

10、br>　　5.溫度和魚(yú)油含量對(duì)金錢(qián)魚(yú)Vtg基因表達(dá)的影響
　　克隆獲得金錢(qián)魚(yú)Vtg基因保守區(qū)片段1449bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Vtg在金錢(qián)魚(yú)卵巢中的表達(dá)量均顯著低于肝臟中的表達(dá)量；23℃和26℃組金錢(qián)魚(yú)Vtg在肝臟中的表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而29℃組Vtg表達(dá)量不變，23℃和26℃組Vtg表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05），但6周時(shí)顯著高于29℃組(P<0.05)；8周時(shí)，6%魚(yú)油組Vtg在肝臟中的表達(dá)量明顯高于對(duì)