蘇、魯、川地區(qū)禽坦布蘇病毒病的流行情況調(diào)查及三重抗體ELISA方法的建立.pdf

1、為了解坦布蘇病毒病在我國(guó)家禽類中的流行情況，應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)江蘇、山東、四川的鴨、雞和鵝進(jìn)行了抗坦布蘇病毒抗體測(cè)定，并對(duì)可疑病例的病料進(jìn)行了病毒分離。2012年5月至2013年1月江蘇省抗體陽(yáng)性率為78.5％(142/181)，四川省抗體陽(yáng)性率為0(0/40)。其中抗體陽(yáng)性地區(qū)紹興鴨（蛋鴨）的抗體陽(yáng)性率為90.9％(100/110)，楓葉鴨（種鴨）為65.6％(40/61)，櫻桃谷鴨（種鴨）為20％(2/10)。通過(guò)對(duì)南京某鴨群

2、多次抗體檢測(cè)結(jié)果表明，5月和次年1月抗體水平較低，9月抗體水平較高，5月到9月份抗體水平呈升高趨勢(shì)，9月到次年1月呈下降趨勢(shì)。
　　2012年10月至2013年1月江蘇部分地區(qū)的84份雞血清（卵黃）抗坦布蘇病毒抗體總體陽(yáng)性率為57.1％(49/84)。溧陽(yáng)抗體陽(yáng)性率為84.6％(11/13);南京抗體陽(yáng)性率為57.7％(15/26);鎮(zhèn)江抗體陽(yáng)性率為51.1％(23/45)。蛋雞的抗體陽(yáng)性率為66.7％(26/39)，肉雞的抗體陽(yáng)

3、性率為51.1％(23/45)。應(yīng)用套式RT-PCR方法檢測(cè)10份肉雞可疑病料，結(jié)果病原陽(yáng)性率為0(0/10)。
　　應(yīng)用酶標(biāo)鴨二抗間接ELISA方法對(duì)2012年6月至2013年3月采集的江蘇、山東、四川的317份鵝血清進(jìn)行測(cè)定，江蘇抗體陽(yáng)性率為55.8％(144/258);山東抗體陽(yáng)性率為23.1％(9/39);四川抗體陽(yáng)性率為0(0/20)。抗體陽(yáng)性地區(qū)肉鵝的抗體陽(yáng)性率為75.5％(102/135);種鵝抗體陽(yáng)性率34.1％(

4、42/123);朗德鵝抗體陽(yáng)性率為23.1％(9/39)。應(yīng)用套式RT-PCR方法檢測(cè)43份肉鵝可疑病料，結(jié)果病原陽(yáng)性率為4.65％(2/43)，通過(guò)接種雞胚獲得2株坦布蘇病毒，病毒NS5部分基因測(cè)序結(jié)果表明，2個(gè)毒株與近年分離的禽坦布蘇病毒同源性均在99％以上。
　　用提取的鵝IgG免疫綿羊，三次免疫后，當(dāng)抗鵝抗體達(dá)到較高滴度時(shí)進(jìn)行采血，辛酸硫酸銨法提取羊血清中的抗鵝IgG抗體，純化后用于ELISA方法檢測(cè)鵝血清中的抗坦布蘇病毒

5、抗體。該ELISA方法的程序是以純化的重組E蛋白作為包被抗原，加入鵝血清，再加入自制的羊抗鵝二抗，最后加入酶標(biāo)兔抗羊抗體，加入底物顯色。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳抗原包被濃度為4μg/ml,抗原包被最適條件為4℃包被過(guò)夜;血清抗體最佳稀釋度為1∶28;羊抗鵝二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶400，最佳作用時(shí)間為2h;三抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶8000，最佳作用時(shí)間為1h;結(jié)果判定采用以X+3SD為陰陽(yáng)性臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定了該方法的敏感性和可