稻瘟菌P型ATP酶的基因家族分析及其基因MoCTA1、MoCTA3的研究.pdf

1、稻瘟菌是水稻的主要病原菌之一，是全球主要稻區(qū)最具毀滅性的病原菌，同時也是植物-真菌互作研究的模式真菌。稻瘟菌致病機理的研究，可以為制定稻瘟菌的持續(xù)管理策略和抗病品種的培育提供理論基礎(chǔ)。P型ATP酶是一類位于質(zhì)膜上的可以被ATP驅(qū)動并發(fā)生磷酸化的陽離子泵，在植物物質(zhì)運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞膜穩(wěn)定性等方面具有重要作用。已有的研究表明，稻瘟菌的P-ATPase編碼基因在其附著胞發(fā)育及致病性過程中具有重要作用。本文通過生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)在稻瘟

2、菌中存在有23個P-ATPase的編碼基因；利用PCR的方法克隆了其中一個基因MoCTA3，并研究了其表達情況；通過基因敲除技術(shù)成功獲得了MoCTA1基因的缺失突變體，并對其表型進行了分析。具體研究結(jié)果如下：
　　 1.通過數(shù)據(jù)庫中P-ATPases的氨基酸序列對稻瘟菌的全基因組表達(CodingSequence，CDS)數(shù)據(jù)庫進行搜索和分析，共發(fā)現(xiàn)有23個P-ATPases基因，進化樹分析結(jié)果顯示這23個基因分屬于4個家族和7

3、個亞家族。運用MEME程序分析這些P-ATPases蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)有6條基序在90％以上的氨基酸序列中均有出現(xiàn)。對這些基因的GC含量分析結(jié)果表明，它們的平均GC含量(0.519-0.62)，稍高于稻瘟菌整個基因組的平均值(0.516)，同時這些基因內(nèi)各區(qū)段GC含量變化不大，沒有明顯的梯度變化。
　　 2.利用PCR的方法，從稻瘟菌中克隆了一個P-ATPase基因MoCTA3。對其進行了序列分析和氨基酸序列比對，并通過qRT-

4、PCR檢測了該基因在稻瘟菌侵染水稻葉片0h、48h、72h、96h，4個不同時期以及菌絲階段的表達情況。結(jié)果表明該基因全長3747bp，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼1096個氨基酸，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，第24-98位有一個保守的鈣離子轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；與朱紅叢赤殼、尖孢鐮刀菌、蝗綠僵菌、炭疽菌等真菌的P-ATPase氨基酸相似性分別為77％、78％、83％和79％；基因表達結(jié)果顯示該基因在菌絲階段的表達量明顯高于侵染階段，侵染過程中隨侵染

5、時間延長表達量逐漸升高，72h時達到高峰，隨后降低，說明MoCTA3可能參與了稻瘟菌的侵染過程，在稻瘟菌的致病性方面具有重要作用。
　　 3.通過基因敲除的方法得到稻瘟菌P-ATPase基因Mo6CTA1的缺失突變體。表型分析發(fā)現(xiàn)，在CM和PDA培養(yǎng)基上，⊿MoCTA1的氣生菌絲生長致密，但生長速度與野生型相比卻顯著降低，而在產(chǎn)孢板上的氣生菌絲疏松，生長速度無明顯差異。GFP表達結(jié)果表明，MoCTA1的表達產(chǎn)物主要集中在孢子的隔