Caco-2細胞中葡萄糖、中性氨基酸和二肽(Lys-Phe)轉(zhuǎn)運載體基因和蛋白表達對底物反應(yīng)模式的比較研究.pdf

1、本試驗就是在mRNA和蛋白水平上，通過比較三種轉(zhuǎn)運載體(葡萄糖、中性氨基酸、二肽)對底物的反應(yīng)模式，評估小肽吸收是否具有營養(yǎng)學(xué)意義。
　　 試驗一：選用人的結(jié)腸癌細胞(Caco-2細胞)作為小腸營養(yǎng)底物轉(zhuǎn)運的體外模型，觀察饑餓條件下，不同時間點(共20個時間點)肽轉(zhuǎn)運載體PepT1mRNA的表達水平，共分20個處理組，每組六個重復(fù)。設(shè)零時刻為對照組，對照組和各處理組分別對Caco-2細胞進行總RNA的提取，檢測PepT1mRNA

2、的表達。結(jié)果表明，時間與PepT1mRNA相對表達水平線性回歸得到二次函數(shù)：y=-0.000382t2+0.0112t+0.8284(t：時間，y：PepT1mRNA相對表達水平)，相關(guān)系數(shù)r=0.62。當t=15h時，Pept1mRNA表達量最高；短時間的饑餓能夠引起PepT1mRNA的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。隨著時間的延長PepT1mRNA的表達水平逐漸下降。分析可能是細胞為了平衡肽供應(yīng)的短缺而短時間內(nèi)發(fā)生暫時代償性的變化

3、，即增加Caco-2細胞內(nèi)Pept1mRNA水平，從而保證小肽載體的數(shù)量，使小肽的吸收不致減少，這可能是Caco-2細胞對環(huán)境適應(yīng)的一種生理反應(yīng)。
　　 試驗二：本試驗同樣選用人的腸道癌細胞(Caco-2細胞)作為小腸營養(yǎng)底物轉(zhuǎn)運的體外模型。三個試驗：1、Caco-2細胞饑餓2h后添加25mmol/L的葡萄糖，PT-PCR檢測SGLT1mRNA在不同時間點的相對表達量；2、Caco-2細胞饑餓2h后添加0.8mmol/L的二肽(

4、Lys-Phe)，PT-PCR檢測PepT1mRNA在不同時間點的相對表達量；3、Caco-2細胞饑餓2h后添加0.8mmol/L的中性氨基酸(Ser、Thr、Cys、Ala)，PT-PCR檢測ASCT2mRNA在不同時間點的相對表達量；每個試驗分為9個處理組，每組六個重復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運載體SGLT1mRNA在第15min時顯著上調(diào)(P<0.05)，隨時間的延長SGLT1mRNA表達逐漸下調(diào)，24h時SGLT1mRNA相對表達量

5、低于對照組但不顯著(P>0.05)；中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT2mRNA在第15min、30min時表達顯著上調(diào)(P<0.05)，15min、30minASCT2mRNA表達無差異(P>0.05)，而后隨時間延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，24h時ASCT2mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)；小肽轉(zhuǎn)運載體PepT1mRNA的水平隨著時間呈現(xiàn)波浪下降的趨勢，且在第10min、30min、120min、24hPepT1mRNA的表達最高，與

6、對照組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明：Caco-2細胞饑餓2h后添加底物均能夠在短時間內(nèi)增加相應(yīng)轉(zhuǎn)運載體mRNA的表達，進而通過增加轉(zhuǎn)運載體的數(shù)量來轉(zhuǎn)運底物，隨著時間的延長轉(zhuǎn)運載體蛋白可能處于一種動態(tài)平衡，再反過來調(diào)節(jié)載體mRNA的表達。固定底物濃度，三種轉(zhuǎn)運載體mRNA對時間的反應(yīng)模式基本一致。
　　 試驗三：本試驗從mRNA和蛋白兩個水平來研究不同濃度的底物對相應(yīng)轉(zhuǎn)運載體表達的影響，Caco-2細胞作為體外營養(yǎng)轉(zhuǎn)運的

7、模型。三個試驗分別是Caco-2細胞饑餓2h后添加不同濃度的底物，孵育24h后提取總RNA和蛋白，檢測相應(yīng)轉(zhuǎn)運載體的表達，分別有6個處理組，每個處理6個重復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組各轉(zhuǎn)運載體mRNA的表達水平均高于各處理組(P<0.05)，底物濃度梯度增加對各自轉(zhuǎn)運載體mRNA的表達均無顯著影響(P>0.05)。葡萄糖濃度梯度增加能夠上調(diào)SGLT1蛋白表達水平(P<0.05)，但是50mmol/L、100mmol/L對SGLT1蛋白水平無顯著

8、影響(P>0.05)；二肽(Lys-Phe)和中性氨基酸(Ser、Thr、Cys、Ala)濃度梯度增加對各自轉(zhuǎn)運載體蛋白表達無影響僅有上升的趨勢(P>0.05)。上述結(jié)果表明，在本試驗濃度范圍條件下，三種轉(zhuǎn)運載體基因和蛋白水平受底物濃度影響不大，但是饑餓卻均能顯著促進各轉(zhuǎn)運載體mRNA水平的表達，分析可能是轉(zhuǎn)運載體蛋白在mRNA合成和蛋白降解中維持著一個動態(tài)平衡；與葡萄糖、中性氨基酸結(jié)果相比，底物肽對肽轉(zhuǎn)運載體的影響與前兩者所觀察的表象