Bt毒素對稻飛虱安全性評價和活性菌株篩選.pdf

1、稻飛虱是水稻上最主要的害蟲之一，主要包括褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱，給水稻的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,簡稱Bt）產(chǎn)品以其高效安全、對目標(biāo)害蟲的特異性而倍受親睞，并逐漸成為研究最深入、應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑。目前關(guān)于Bt防治害蟲的研究主要集中在鱗翅目、鞘翅目等防治效果顯著的害蟲中，帶來了很好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，但尚未見到對稻飛虱有毒力菌株的報道。
　　 為了實現(xiàn)用Bt類產(chǎn)品防治稻

2、飛虱，開發(fā)利用對稻飛虱有特效的Bt制劑，本文首先建立了測定殺蟲化合物對稻飛虱潛在影響的Tier-1毒性測定模型，并用該模型對已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入水稻的Bt毒素對非靶標(biāo)害蟲稻飛虱進(jìn)行風(fēng)險評價，以預(yù)測稻飛虱在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻田間發(fā)生與為害的可能趨勢。Bt毒素與害蟲中腸BBMV上的受體結(jié)合是毒素發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵步驟，因此本文對稻飛虱可能的Bt受體堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，簡稱ALP)從生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面進(jìn)行初步研

3、究，克隆到兩條ALP的基因并對其功能進(jìn)行鑒定;最后對大量標(biāo)準(zhǔn)的Bt菌株進(jìn)行室內(nèi)生物測定，篩選對稻飛虱有活性及特異性菌株，為后續(xù)發(fā)展轉(zhuǎn)Bt基因水稻防治稻飛虱提供理論基礎(chǔ)。
　　 通過對以上內(nèi)容的研究，得出了以下幾點結(jié)論:
　　 一、Bt毒素對非靶標(biāo)害蟲稻飛虱的風(fēng)險評價
　　 首先選用合適的人工飼料發(fā)展了一套評價純殺蟲蛋白對灰飛虱潛在影響的毒性測定模型，用E-64和PA作為模式化合物驗證所建立的Tier-1試驗?zāi)Ｐ偷?/p>

4、靈敏性，試驗結(jié)果顯示，本試驗建立的Tier-1毒性測定模型具有較高的靈敏度。借助此模型就Cry2Aa殺蟲蛋白對灰飛虱生存率、若蟲發(fā)育歷期和初羽化成蟲鮮重的影響作較系統(tǒng)研究，結(jié)果表明Cry2Aa對灰飛虱無毒性影響。另外，試驗中還通過ELISA和靶標(biāo)昆蟲生測技術(shù)全程監(jiān)測殺蟲化合物的濃度、穩(wěn)定性及生物活性。
　　 二、兩種堿性磷酸酯酶的生化及分子生物學(xué)初步研究
　　 本文克隆和測定酶活性均以褐飛虱的整個蟲體做為研究對象，采用超

5、速離心的方式分離純化了可溶性和膜結(jié)合兩種堿性磷酸酯酶，在最佳pH環(huán)境下測定兩種堿性磷酸酯酶的酶活性;并采用簡并引物PCR和RACE技術(shù)克隆了褐飛虱兩種堿性磷酸酯酶的全長基因，這是在半翅目昆蟲中率先鑒定出來的堿性磷酸酯酶基因。它們與其它昆蟲的堿性磷酸酯酶序列都具有40％-50％的相似性，序列比對分析顯示兩種堿性磷酸酯酶都存在一個假定的堿性磷酸酯酶的信號區(qū)域和13個重要功能氨基酸。此外，N1-ALP2包含一個假定的GPI錨定的位點，而N1-

6、ALP1沒有該位點。并通過WesternBlotting實驗直接證明這兩個基因分別編碼可溶性的和膜結(jié)合的堿性磷酸酯酶，因此將兩個基因分別命名為N1-sALP和N1-mALP。
　　 三、對稻飛虱有活性的Bt菌株的篩選
　　 本文利用人工飼料對灰飛虱進(jìn)行大量Bt菌株篩選，利用該方法對68株標(biāo)準(zhǔn)的Bt菌株進(jìn)行活性篩選，結(jié)果篩選到1株其晶體蛋白和可溶性小分子均對灰飛虱有較高毒性的Bt菌株T42001，且對其進(jìn)一步分離純化后得到