玉米西羅葉綠三酸鐵螯合酶基因分離和功能研究.pdf

1、西羅血紅素是最簡單的功能四吡咯分子，它作為亞硝酸還原酶和亞硫酸還原酶的輔基，參與植物N和S的同化。西羅血紅素的合成發(fā)生在質(zhì)體中，經(jīng)過甲基化、氧化、鐵螯合三步反應(yīng)。西羅葉綠三酸鐵螯合酶是西羅血紅素生物合成的關(guān)鍵酶，它是合成四吡咯分子的第二類螯合酶，它的活性不需要ATP參與。目前植物中僅有擬南芥西羅葉綠三酸鐵螯合酶(SirB)的相關(guān)研究，本文初步研究了玉米西羅葉綠三酸鐵螯合酶(ZmSFC)及其突變體ZmSFCM1、ZmSFCM2在大腸桿菌中

2、的重組表達(dá)和純化，并對ZmSFC及突變體ZmSFCM1的蛋白進(jìn)行了光譜學(xué)和電子順磁共振分析，通過熒光定量PCR分析了不同濃度硝酸鹽或硫酸鹽處理后玉米葉片中ZmSFC基因的表達(dá)情況。獲得如下主要結(jié)果：
　　 1.提取玉米B73自交系葉片的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增出編碼ZmSFC的成熟基因，插入pMF-Dute-1表達(dá)載體中，0.5mmol/L的IPTG，28℃誘導(dǎo)12h，Ni-NTA親和純化ZmSFC蛋白，SDS-P

3、AGE顯示純化的蛋白為一條主帶，亞基分子量大小約為18kDa。
　　 2.設(shè)計(jì)引物定點(diǎn)突變ZmSFC蛋白，第一輪突變一個氨基酸殘基，獲得突變體ZmSFCM1(C60A)，在第一輪的基礎(chǔ)上進(jìn)行第二輪突變，獲得三個氨基酸殘基突變的突變體ZmSFCM2(C60A，E42I，P43A)。分別對這個兩個突變體進(jìn)行蛋白的表達(dá)和純化，SDS-PAGE顯示純化的蛋白亞基分子量大小與原蛋白表達(dá)一致。
　　 3.純化得到的ZmSFC和ZmS

4、FCM1蛋白進(jìn)行光譜學(xué)分析，紫外可見光譜掃描顯示，在315nm、415nm和519nm處有三處吸收峰，這三處吸收峰均為蛋白中含有鐵硫簇的典型吸收峰，表明純化的ZmSFC和ZmSFCM1蛋白中含有Fe-S簇結(jié)構(gòu)。電子順磁共振波譜表明純化的ZmSFC和ZmSFCM1均含有[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)。這表明第一個保守的半光氨酸殘基不參與Fe-S簇的形成。
　　 4.將ZmSFCM1和ZmSFCM2蛋白濃度超濾至12mg/mL，母液為20mm

5、ol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，pH8.0。采用懸滴法，HamptonScreenⅠ&Ⅱ98種篩選條件，在10℃恒溫生長一周后，17號條件獲得微晶，為棒狀晶型。17號條件為：0.2M硫酸鋰，0.1MTris-HCl，pH8.5，30％PEG4000。
　　 5.分別用不同濃度的硝酸鈉和硫酸鉀對玉米幼葉進(jìn)行處理，25℃4h后，提取葉片總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明：20mmol/L的NaNO3和5

6、0mmol/L的K2SO4處理后，玉米葉片中ZmSFC基因表達(dá)量最高。
　　 綜上所述，本研究獲得了玉米編碼成熟ZmSFC的基因，獲得兩個突變體ZmSFCM1(C60A)和ZmSFCM2(C60A，E42I，P43A)，分析了它們在大腸桿菌中的重組表達(dá)，親和純化獲得了蛋白，紫外可見光譜掃描和電子順磁共振波譜表明純化的蛋白中存在Fe-S簇結(jié)構(gòu)，兩個突變體的蛋白進(jìn)行晶體生長，初步獲得了微晶，熒光定量PCR表明低濃度的硝酸鈉或硫酸鉀處