隱孢子蟲禽基因型V生物學(xué)特性和分子遺傳學(xué)特征研究.pdf

1、隱孢子蟲是家養(yǎng)、籠養(yǎng)和野生禽類最常見的寄生蟲之一。目前，公認的寄生于禽類的隱孢子蟲有3個有效種，分別為貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumbaileyi)，火雞隱孢子蟲(C。meleagridis)和雞隱孢子蟲(C.galli)。關(guān)于隱孢子蟲禽基因型Ⅴ(CryptosporidiumaviangenotypeⅤ)只有兩篇報道，報道僅限于流行病學(xué)和分子生物學(xué)特征研究。
　　 為研究隱孢子蟲禽基因型V的生物學(xué)特性，即卵囊形態(tài)

2、、感染寄生宿主、感染寄生部位。本試驗從鄭州寵物市場采集雞尾鸚鵡的糞便，使用飽和蔗糖溶液漂浮法進行檢測，陽性樣品保存在2.5％的重鉻酸鉀溶液中。隱孢子蟲卵囊純化后基于18SrRNA基因位點進行巢式PCR擴增，確定其為禽基因型Ⅴ，用于試驗。30只3日齡雛雞、15只3日齡雛鴨、6只40日齡羅曼公雞、8只30日齡BALB/c小鼠、8只30日齡蒙古沙鼠、30只10日齡鵪鶉、6只虎皮鸚鵡，每只動物經(jīng)口灌喂1×106個卵囊，另外同等數(shù)量的動物灌喂等體

3、積蒸餾水作為對照組。采用飽和蔗糖溶液漂浮法和血細胞計數(shù)法檢查感染后排卵囊規(guī)律，同時剖殺動物檢查寄生部位。經(jīng)調(diào)查隱孢子蟲禽基因型Ⅴ只自然感染雞尾鸚鵡；動物交叉感染試驗中隱孢子蟲禽基因型Ⅴ的卵囊成功感染3日齡雛雞，潛隱期為8d，顯露期為20d；感染3日齡雛鴨，潛隱期為9d，顯露期為19d；感染40日齡羅曼公雞，潛隱期為8d，顯露期為9d；隱孢子蟲禽基因型Ⅴ不感染10日齡鵪鶉、30日齡BALB/c小鼠、30日齡蒙古沙鼠和30日齡虎皮鸚鵡。石蠟

4、組織切片和掃描電子顯微鏡觀察，隱孢子蟲禽基因型Ⅴ只寄生于感染動物法氏囊黏膜上皮細胞中，且在法氏囊黏膜皺襞邊緣寄生較多。經(jīng)微分干涉顯微鏡觀察并測量卵囊大小，隱孢子蟲禽基因型Ⅴ的卵囊大小為(4.58-5.89)μm×(3.98-4.83)μm，平均為5.42μm×4.46μm，卵囊指數(shù)為1.22。
　　 為研究隱孢子蟲禽基因型Ⅴ的分子遺傳學(xué)特征。本試驗選取18SrRNA、actin、HSP70和COWP基因位點進行巢式PCR擴增，對

5、擴增產(chǎn)物進行測序分析；對18SrRNA的第二套擴增產(chǎn)物進行RFLP試驗。隱孢子蟲禽基因型Ⅴ的18SrRNA、actin、HSP70基因位點擴增目的片段長度分別為830bp、1066bp、1950bp；COWP基因位點未擴增出目的條帶；RFLP試驗中禽基因型V的SspⅠ酶切片段大小均為497bp，253bp；VspⅠ酶切片段大小為621bp，115bp，104bp；18SrRNA基因位點種系發(fā)育結(jié)果顯示隱孢子蟲禽基因型Ⅴ與隱孢子蟲禽基因型

6、Ⅱ在同一進化枝中，同源性為99.4％，與C.baileyi組成一個大分支，同源性為96.4％；actin基因位點種系發(fā)育結(jié)果顯示隱孢子蟲禽基因型Ⅴ與隱孢子蟲禽基因型Ⅱ在同一進化枝中，同源性為98.2％，與C.baileyi組成一個大分支，同源性為89.8％；HSP70基因位點的種系進化分析顯示隱孢子蟲禽基因型Ⅴ與隱孢子蟲禽基因型Ⅱ在同一進化枝中，同源性為95.7％，與C.baileyi的分支較遠，同源性僅為88.6％。以上結(jié)果均顯示隱孢