分子遺傳學筆記

1、11分子遺傳學緒論核酸的發(fā)現(xiàn):作為遺傳物質(zhì)所應具備的條件：1多樣性：貯存并表達多種遺傳信息2連續(xù)性：準確傳遞后代3穩(wěn)定性：物理、化學性質(zhì)穩(wěn)定4多變性：有遺傳變化的能力一、DNA作為遺傳物質(zhì)的證據(jù)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗病毒侵染大腸桿菌試驗真核細胞的基因轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：某一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的細胞的DNA而使它的基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。二、DNA的一級結(jié)構(gòu)核酸的化學組成：核酸是以核苷酸為基本結(jié)構(gòu)單位，通過3’5’磷酸二

2、酯鍵形成的鏈狀多聚體。核苷酸(Nucleotide)：核苷(Nucleoside)，含氮堿基，戊糖；磷酸基團三、DNA的二級結(jié)構(gòu)1、DNA雙螺旋模型的誕生：Watson在復性反應中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過哪些方法來檢測？(1)減色效應（hpochromiceffect）測定光密度，即OD值（opticaldensity），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石對雙鏈DNA吸附較牢，不

3、易吸附單鏈而使其通過七、分子雜交1特點是：(1)都是應用復性動力學原理；(2)都必須有探針（probe）的存在。2探針就是用同位素或非同位素如熒光染料，生物素等標記的短片段特異DNA或RNA序列。3雜交：不同來源的單鏈核酸經(jīng)堿基互補配對而形成的雙螺旋，DNADNADNARNADNA雜交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的進化，核酸雜交是現(xiàn)代分子生物學的基礎(chǔ)4常用的分子雜交方法_原位分子雜交（insituhybridiz

4、ation）_斑點雜交（dotblotting）_薩瑟雜交（Southernblot）_諾瑟雜交（Nthernhybridization）_Westernblotting八、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)和拓撲異構(gòu)現(xiàn)象1生物體中大多數(shù)DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA則為松弛型DNA原核生物DNA，共價封閉環(huán)，再經(jīng)螺旋就成為超螺旋。真核生物DNA為線性，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合之間的DNA可形成一個小“環(huán)”，類似共價封閉環(huán)，從而螺旋成為超螺旋

5、2正超螺旋：和DNA內(nèi)部雙螺旋纏繞方向相同的方向纏繞形成的超螺旋，結(jié)構(gòu)更加緊密。DNA每圈初級螺旋的堿基對小于10.5，則為正超螺旋3負超螺旋：DNA繞其軸與右手雙螺旋方向相反的方向纏繞所產(chǎn)生的超螺旋，結(jié)果減少每個堿基對的旋轉(zhuǎn)，每圈初級螺旋的堿基對大于10.5，則為負超螺旋。超螺旋是耗能過程，超螺旋的產(chǎn)生可能為能量的儲存形式4拓撲異構(gòu)現(xiàn)象拓撲異構(gòu)酶Ⅰ催化DNA鏈斷裂和重新連接。每次只作用于一條單鏈，無需ATP，功能是松弛DNA，代表：E

6、.coli拓撲異構(gòu)酶Ⅰ，對單鏈DNA的親和力比雙鏈高，能識別負超螺旋區(qū)，使負超螺旋擴大化而成松弛狀，該酶不能松弛正超螺旋；真核生物拓撲異構(gòu)酶Ⅰ可結(jié)合1519核苷酸的雙鏈區(qū)域其斷裂點在此區(qū)域中間.該酶傾向于結(jié)合超螺旋而不是結(jié)合松弛DNA區(qū)域?qū)φ摮菪加兴沙诠δ?拓撲異構(gòu)酶Ⅱ大腸桿菌拓撲異構(gòu)酶Ⅱ又稱DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)，能催化斷裂和連接雙鏈DNA，需能量ATP參與，無堿基序列特異性，DNA旋轉(zhuǎn)酶結(jié)合到雙鏈閉環(huán)分子中在ATP

7、的作用下產(chǎn)生負超螺旋。無ATP時只能緩慢松弛負超螺旋而不能松弛正超螺旋。大腸桿菌拓撲異構(gòu)酶Ⅱ主要功能是引入負超螺旋以抵消復制叉移動所產(chǎn)生的正超螺旋，還具有形成或拆開雙鏈DNA環(huán)連體的能力。該酶對DNA的結(jié)合順序是正超螺旋松弛負超螺旋5拓撲異構(gòu)酶的生物學功能：_恢復細胞過程產(chǎn)生的DNA超螺旋，如復制叉前的正超螺旋、轉(zhuǎn)錄時聚合酶前產(chǎn)生的正超螺旋。_防止細胞DNA過度超螺旋，維持超螺旋的穩(wěn)定水平。生物體內(nèi)5％負超螺旋，有利于基因的轉(zhuǎn)錄、基因組

8、穩(wěn)定、促進重組。_去連環(huán)活性（大腸桿菌）、染色體凝縮（真核）、解開纏繞DNA雙螺旋6拓撲異構(gòu)酶的催化反應本質(zhì)：是先切割DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA鏈環(huán)數(shù)后再連接，兼具DNA內(nèi)切酶和DNA連接酶的功能，但是它不能連接事先已經(jīng)存在的斷裂DNA，是DNA復制、重組和轉(zhuǎn)錄中必需的酶九、常見DNA分子形式及相互關(guān)系Ⅰ型DNA：具正、負超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNAS＝1.41；Ⅰ’型DNA：無超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNA，是松弛型S=1.14；Ⅱ型DNA：一

9、條鏈或兩條鏈上有一個或幾個切口的雙鏈環(huán)狀DNAS=1.14；Ⅲ型DNA：線形雙鏈DNAS=1.00；崩潰DNA：Ⅰ型或Ⅰ’型DNA變性時，氫鍵斷裂但兩條鏈無法分離而緊密纏繞的分子S=3.0單鏈環(huán)狀DNA：S=1.14線狀單鏈DNA：S=1.30連環(huán)狀DNA：兩個Ⅰ型DNA環(huán)連而成。S1.41沉降系數(shù)：CsCl密度梯度離心時的表示單位。CsCl本身有梯度，在離心時將不同分子大小的物質(zhì)集中到它自身的不同梯度中。在同一種密度梯度離心條件下，沉

10、降系數(shù)大表示易沉淀，則具有較高的超螺旋。鑒定DNA超螺旋的手段。第二章染色體、基因組和基因一、原核生物和真核生物真核生物：有完整的細胞結(jié)構(gòu)；遺傳物質(zhì)集中在有核膜包圍著的細胞核中與特殊的蛋白質(zhì)相33串聯(lián)重復基因和基因家族的區(qū)別??串聯(lián)重復基因各成分間有高度的序列一致性甚至完全相同以同一基本單位進行重復?；蚣易甯鞒蓡T的差別較大，以各自為基本單元重復拷貝數(shù)較高，常有幾十～幾百個?；蚣易蹇截悢?shù)不高。非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)短而一致。基因家族各成員的非

11、轉(zhuǎn)錄的間隔長短不一.tRNA（4S基因)小分子，75～90個核苷酸，20余種氨基酸約由40余種tRNA。酵母tRNA，長約140kb，有內(nèi)含子，但各內(nèi)含子沒有序列的共同性。串聯(lián)成堆排列，間隔區(qū)較大，重復基因的起源：?滾環(huán)模型，不等交換，突然復制假說3、細胞器基因葉綠體、線粒體含有DNA，環(huán)狀、非重復。同一線粒體或葉綠體內(nèi)含有相同環(huán)狀DNA。均編碼自身所需的某些蛋白質(zhì)及rRNA、tRNA。其余所需的蛋白質(zhì)均由核基因編碼。葉綠體、線粒體的膜

12、不允許核酸的通過。其合成的rRNA，mRNA和tRNA只能在細胞器內(nèi)行使功能，進行翻譯，合成系統(tǒng)是細胞器專用的。線粒體基因組呈母系遺傳方式受精卵中線粒體基因組幾乎都來自卵子在減數(shù)分裂過程中，卵子的線粒體DNA分子完全隨機地分配到兩個子代細胞中人類線粒體基因組雙鏈環(huán)狀DNA基因排列高度緊湊，總長為16569bp，約93％的順序參與基因的編碼DNA兩條鏈的堿基組成差異很大：重鏈（H鏈）富含鳥嘌呤輕鏈（L鏈）富含胞嘧啶細胞內(nèi)的數(shù)目：數(shù)千拷貝第

13、三章DNA復制DNAreplication一、復制概況1、半保留復制(Semiconservativereplication)復制時以解開的雙鏈DNA中的一條鏈作為模板通過堿基互補配對原則合成另一條新鏈由新合成的子鏈與母鏈組成一新的DNA雙鏈其序列與母雙鏈完全相同.DNA復制的可能方式:分散復制，半保留，全保留1958Meselson和Stahl用實驗證明了DNA的半保留復制機制2、制起點復、復制子、方向和方式復制起點(iO):復制是在

14、DNA分子的特定位點開始的這一位點被稱為復制起點.一般富含AT序列。復制起點的數(shù)目原核生物染色體通常只有一個復制起點，復制從起點開始，進行到終點結(jié)束，完成整個DNA分子的復制。（一個復制單元）真核生物染色體DNA的復制是從多個位點（多個復制起點），一個DNA分子上具有多個復制單元。復制子(replicon)：復制從起始到結(jié)束的DNA單位稱為一個復制子，是基因組中能獨立進行復制的單位。在每個細胞分裂周期中，每個復制子只啟動一次。復制子中含

15、有復制需要的控制元件。在復制的起始位點具有原點，在復制的終止位點具有終點（Terminus)??復制方向?復制可能是單向的，也可能是雙向的。這是由從原點形成一個或兩個復制叉決定的。?復制叉(Replicationfk)：復制發(fā)生的位點，是雙鏈分開的復制起點位置。復制叉從i開始沿著DNA移動。一個復制叉：復制時復制叉移動產(chǎn)生單向復制?二個復制叉：復制時相背向移動，產(chǎn)生雙向復制大多數(shù)生物DNA都是以雙向等速方式進行復制?雙向復制時復制叉的移

16、動不對稱單核苷酸是在3‘端加上，復制方向或鏈的延伸方向：5’→3’復制方式復制叉式(θ復制)：在復制原點產(chǎn)生復制叉，雙鏈環(huán)狀DNA的復制叉式類似“θ”，又稱θ復制。滾環(huán)式(Rollingcircle):DNA雙鏈環(huán)的一條鏈斷裂，5’端和特定的蛋白質(zhì)相連，而在3’端不斷由DNA聚合酶催化向前延伸，以未切斷的一條環(huán)鏈為模板進行合成。老環(huán)中另一條親鏈的5’端不斷拋出，似一個環(huán)在滾動。類似“δ”，又稱“δ”復制，被拋出的鏈到一定長度時則開始復制

17、其互補鏈。3、DNA復制的半不連續(xù)性半不連續(xù)復制模型：DNA雙鏈中一條鏈的復制合成是連續(xù)的，另一條鏈是不連續(xù)的。1968年由岡崎等人提出：模板鏈（5’→3’）仍按堿基互補，但從反方向合成多個5′→3′DNA片段（岡崎片段），約長10002000核苷酸。合成的方向和復制叉移動的方向相反。以3’5’鏈作為模板合成的DNA為先導鏈（leadingstr）以5’3’鏈作為模板合成的DNA為后隨鏈4、DNA聚合酶與DNA聚合反應DNA復制是由DN

18、A聚合酶以四種核苷三磷酸為前體負責催化完成的。Knberg（1957）首次發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），以后又發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）和DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）poly(核苷酸)nOH3’dNTP→poly(核苷酸)n1OH3’ppi二、復制體系?多種酶和蛋白質(zhì)（E.coli中有30多種）參與DNA的復制。與復制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)稱為復制體系(Replisome)。?雙鏈DNA的復制是一個涉及酶活動的復雜的聚合反應過程，可分為起

19、始、延伸和終止三個不同的階段。.1、DNA復制體系的鑒定_利用條件致死突變體研究與復制有關(guān)的基因?溫度條件致死突變體：?快停突變體：當溫度升高，復制立即停止，其基因產(chǎn)物是DNA鏈的延伸及岡崎片段的起始和連接所需的酶，與DNA延伸所需的酶和蛋白質(zhì)有關(guān)。?慢停突變體：當溫度升高，可完成當前復制，但不能開始新一輪的復制，其基因產(chǎn)物與復制起始有關(guān)。蛋白質(zhì)鑒定方法：純化、重建、突變ProteinsinDNAReplication：1.DNA解旋酶

20、（DNAHelicases）2.單鏈結(jié)合蛋白（DNAsinglestredbindingproteins，SSB蛋白）3.DNA拓撲異構(gòu)酶(DNATopoisomerase)4.DNAPolymeraseDNAPolymeraseI(PolI)wasthefirstenzymediscoveredwithpolymeraseactivityitisthebestacterizedenzyme.Althoughthiswasthefirs

21、tenzymetobediscoveredthathadtherequiredpolymeraseactivitiesitisnottheprimaryenzymeinvolvedwithbacterialDNAreplication.ThatenzymeisDNAPolymeraseIII(PolIII).ThreeactivitiesareassociatedwithDNApolymeraseI5.引發(fā)酶（Primase）There

22、quirementfafree3hydroxylgroupisfulfilledbytheRNAprimersthataresynthesizedattheinitiationsitesbytheseenzymes.6.DNA連接酶（DNALigase）DNA復制是由DNA聚合酶以四種核苷三磷酸為前體負責催化完成的。DNApolymerasesareenzymesthatsynthesizeadaughterstr(s)ofDNA(un

23、derdirectionfromaDNAtemplate).Maybeinvolvedinrepairreplication.DNAreplicaseisaDNAsynthesizingenzymerequiredspecificallyfreplication.RepairofdamagedDNAcantakeplacebyrepairsynthesiswhenastrthathasbeendamagedisexcisedreplac

24、edbythesynthesisofanewstretch.Itcanalsotakeplacebyrecombinationreactionswhentheduplexregioncontainingthedamagedisreplacedbyanundamagedregionfromanothercopyofthegenome.DNApolymerasesaretheenzymesthatmakeDNASemiconservativ

25、ereplicationsynthesizestwonewstrsofDNA.RepairsynthesisreplacesadamagedstrofDNA.DNAsynthesisoccursbyaddingnucleotidestothe3’OHendofthegrowingchainsothatthenewchainissynthesizedinthe5’3’direction.TheprecursfDNAsynthesisisa

26、nucleosidetriphosphatewhichlosestheterminaltwophosphategroupsinthereaction.三種E.coliDNA聚合酶:?DNA聚合酶I:polA基因編碼103KD單鏈多肽，參與損傷DNA的修復，在半保留復制中起輔助作用。?DNA聚合酶II:12KD單鏈多肽，在損傷DNA的修復中具有一定作用。?DNA聚合酶III:多亞基組成的蛋白質(zhì)，是大腸桿菌中真正的DNA復制酶。真核生物DN

27、A聚合酶?:synthesisoflaggingstr.?:DNArepair.?:synthesisofleadingstr.?:DNArepair.3、DNA聚合酶引物?DNA聚合酶的一個共同特征是只能催化dNTPs加到已有核酸鏈的游離3’OH上，而不能以游離的單核苷酸起始DNA鏈的合成。因此，在起始合成時需要一段引物提(Primer)來提供3’OH末端才能合成DNA。?～10核苷酸的RNA片斷，與模板鏈結(jié)合，保證DNA復制的保真度

28、，前導鏈和后隨鏈都需引物。?引物由特殊的RNA聚合酶合成，稱引發(fā)酶（primase）。由dnaG基因編碼，單肽鏈，引發(fā)酶與相關(guān)蛋白結(jié)合形成的復合體為引發(fā)體（primosome）。4、螺旋酶?又稱解旋酶（helicase）促進雙鏈解開，是復制、重組、修復過程中的關(guān)鍵酶。依賴ATP水解所產(chǎn)生的能量來解旋DNA雙鏈，螺旋酶在DNA上移動解開雙鏈。?主動機制：解旋酶的兩個結(jié)合點與DNA結(jié)合后，使結(jié)合區(qū)域雙鏈DNA失去穩(wěn)定，實現(xiàn)解旋。?被動機制：