雞SelW過表達CHO-K1細胞系的構建及其抗氧化功能的研究.pdf

1、硒是生物體生命活動的必需微量元素，其主要以硒蛋白的形式發(fā)揮生物學作用。硒蛋白W(SelW)是硒蛋白家族的一員，在多種動物的不同組織中均可表達，并且哺乳動物SelW可以作為一種氧化還原酶。目前關于SelW的研究主要集中于哺乳類動物，如靈長類和嚙齒類。禽類SelW除組織分布研究的較清楚外，其它知之甚少，尤其是雞SelW的體外表達方面的研究還未見報道，雞SelW的生物學作用也研究較少。
　　 本研究根據分子生物學技術構建包含3'UTR

2、區(qū)域SECIS在內的雞SelW真核細胞表達載體和綠色熒光蛋白重組表達載體。通過綠色熒光蛋白重組表達載體對細胞轉染條件進行了優(yōu)化，將雞SelW真核表達載體轉染到中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)細胞中，采用RT-PCR和實時熒光定量PCR(qPCR)技術對轉染后的細胞SelW表達情況進行了檢測，同時還采用qPCR技術檢測了硒蛋白合成相關酶硒代半胱氨酸合成酶(SecS)和硒磷酸化物合成酶(SPS-1)mRNA水平。隨后以雞SelW過表達CHO

3、-K1細胞系和CHO-K1正常細胞為試驗對象，采用AO/EB雙染和TUNEL方法對不同濃度的過氧化氫誘導的細胞凋亡情況進行檢測，同時采用qPCR方法測定過表達細胞系和正常細胞系中Caspase-3、Caspase-8和FasmRNA水平，結果表明：
　　 1根據已知雞SelW cDNA序列，我們設計了能夠克隆出雞SelW SECIS的引物，并成功構建了雞SelW真核細胞表達載體pcDNA3.1/SelW。
　　 2通過限

4、制性內切酶和DNA連接酶，我們成功將pEGFP-N1中的綠色熒光光蛋白基因連接到真核細胞表達載體pcDNA3.1(+)上，構建了重組綠色熒光蛋白表達載體pcDNA3.1/GFP。優(yōu)化轉染試驗中，轉染試劑和pcDNA3.1/GFP的比例為8:2(μL：μg)時轉染效率最高。
　　 3本實驗成功將雞SelW轉染到CHO-K1細胞中，最適條件是六孔板每孔加入8μL轉染試劑和2μg的表達載體。pcDNA3.1/SelW轉染24 h和48

5、 h后，對轉染pcDNA3.1/SelW的細胞和未轉染pcDNA3.1/SelW的細胞中SelW、SecS和SPS-1 mRNA水平進行檢測，經瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示，轉染pcDNA3.1/SelW的細胞中出現(xiàn)了SelW特異性條帶，而未轉染pcDNA3.1/SelW細胞中沒有此條帶的出現(xiàn)，同時qPCR顯示，轉染雞SelW細胞中的SelW mRNA水平明顯高于未轉染細胞，說明我們成功構建了雞SelW過表達細胞系。我們還發(fā)現(xiàn)轉染雞SelW細

6、胞的SecS mRNA水平明顯增高，SPS-1 mRNA水平無明顯變化，我們推測SecS參與了雞SelW的合成，而SPS-1沒有。
　　 4過氧化氫能夠誘導雞SelW過表達細胞系和正常細胞發(fā)生細胞凋亡。經AO/EB雙染和TUNEL法檢測我們發(fā)現(xiàn)，轉染雞SelW細胞的細胞凋亡率明顯低于同水平的過氧化氫誘導的未轉染細胞，同時對細胞凋亡相關基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)，經同濃度過氧化氫誘導的