TRMU-Knockdown小鼠胰島β細(xì)胞系的構(gòu)建及對(duì)其功能影響的研究.pdf

1、目的：
　　本研究實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對(duì)小鼠TRMU基因mRNA的特異性RNAi慢病毒表達(dá)載體，在小鼠胰腺β細(xì)胞(Min6細(xì)胞)中，從轉(zhuǎn)錄水平上抑制TRMU基因的表達(dá)，干擾tRNA的修飾，觀察β細(xì)胞的功能變化來建立一種研究線粒體糖尿病發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞模型。本研究有兩個(gè)主要目標(biāo)：(1)建立線粒體功能障礙的β細(xì)胞系，可用于線粒體糖尿病發(fā)病分子機(jī)制的研究工作；(2)闡明線粒體功能障礙影響β細(xì)胞功能的部分機(jī)制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建

2、TRMU-RNAi慢病毒表達(dá)載體本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠TRMU基因作RNA干擾的靶基因，先設(shè)計(jì)合成針對(duì)TRMU基因mRNA不同位點(diǎn)的shRNA序列，再克隆到線性化的pLVX-shRNA2-GFP慢病毒載體上，分別構(gòu)建出不同靶點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)載體。
　　2、包裝生產(chǎn)TRMU-RNAi慢病毒將構(gòu)建并測(cè)序鑒定好的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)(Lenti-X TMHTX Packaging System)中的輔助質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染慢病

3、毒包裝細(xì)胞，即293T細(xì)胞。在293T細(xì)胞中包裝出具有活性的慢病毒顆粒，濃縮病毒液，用逐孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。
　　3、TRMU-RNAi慢病毒對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞(Min6)功能的影響用包裝好的RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞，觀察細(xì)胞出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)變化；實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)法檢測(cè)干擾慢病毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)TRMU基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制效應(yīng)，以及干擾tRNA的修飾對(duì)tRNA穩(wěn)定性的影響；激光共聚焦技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)

4、染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行Ca++濃度的檢測(cè)；對(duì)其胰島素分泌進(jìn)行檢測(cè)與分析。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照病毒感染組和未感染病毒的正常細(xì)胞組做對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建TRMU-RNAi慢病毒表達(dá)載體本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了針對(duì)TRMU基因mRNA不同位點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序鑒定干擾片斷的堿基序列以及插入的位點(diǎn)完全正確。
　　2、包裝生產(chǎn)TRMU-RNAi慢病毒將重組慢病毒載體質(zhì)粒與輔助包裝載體質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染2

5、93T細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增慢病毒，獲得了高滴度慢病毒上清液。
　　3、TRMU-RNAi慢病毒對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞(Min6)功能的影響通過RT-PCR檢測(cè)RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞后，可以高效抑制TRMU基因的表達(dá)，并影響了tRNA的穩(wěn)定性。激光共聚焦技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行Ca++濃度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度降低。最后，通過胰島素釋放實(shí)驗(yàn)證明了RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞后，胰島素分泌水平明顯受到了抑制。
　　結(jié)論：