肉雞鉻代謝相關(guān)miRNA的鑒定與分析.pdf

1、鉻(Cr)作為一種必需微量元素，在蛋白質(zhì)合成、糖類代謝和脂類代謝等中都發(fā)揮重要作用。三價(jià)鉻離子(Cr3+)是葡萄糖耐量因子(GTF)的活性成分，它協(xié)同GTF增加胰島素的活性進(jìn)而參與機(jī)體組織的各項(xiàng)功能代謝。微小RNA(microRNAs，簡(jiǎn)稱miRNAs)是真核生物中一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的非編碼RNA，與蛋白質(zhì)代謝和骨骼肌分化密切相關(guān)。目前，與雞鉻代謝相關(guān)的miRNA尚未見(jiàn)諸報(bào)道。本研究擬通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)篩選影響肉雞骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的鉻劑量

2、，采用Solexa測(cè)序技術(shù)并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)綜合篩選雞鉻代謝相關(guān)miRNA以獲得差異表達(dá)的miRNA。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1、288只1日齡的愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。4個(gè)處理組的基礎(chǔ)日糧中分別添加0 mg/kg(對(duì)照組)、0.4 mg/kg、2.0 mg/kg或10.0 mg/kg吡啶羧酸鉻(CrPic)。以每個(gè)重復(fù)為單位，分別于21d和42d稱重和結(jié)料，并

3、以每個(gè)重復(fù)為單位隨機(jī)抽取一只肉雞采集血樣檢測(cè)蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，21d時(shí)，各組的平均日增重、平均日采食量和料肉比均差異不顯著(P>0.05)。42 d時(shí)，10.0 mg/kg CrPic組肉雞的平均日采食量顯著增加(P<0.05)；42 d時(shí)，2.0 mg/kg和10.0 mg/kg CrPic組的血清總蛋白含量同對(duì)照組相比差異顯著升高(P<0.05)；10.0 mg/kg CrPic組的肉雞血清葡萄糖濃度顯著降低(P<0.0

4、5)。10.0 mg/kg CrPic組21d和42 d的肉雞血清甘油三酯濃度均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，10.0 mg/kg CrPic在一定程度上能增加肉雞的生產(chǎn)性能和蛋白質(zhì)合成。
　　 2、根據(jù)肉雞生產(chǎn)性能和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果，本試驗(yàn)采用IlluminaSolexa測(cè)序方法分別對(duì)10.0 mg/kg CrPic組和對(duì)照組肉雞骨骼肌的小RNA文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果分別獲得高達(dá)12.7和12.1百萬(wàn)條短序列讀數(shù)。

5、對(duì)miRNA的長(zhǎng)度進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的小RNAs分布在20～23 nt，其中長(zhǎng)度為22nt的序列約為70%～80%。對(duì)長(zhǎng)度為20～24nt的miRNAs的首位堿基進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為22nt的miRNA其首位堿基大部分為尿嘧啶。通過(guò)BLASTN搜索工具利用Rfam和Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)注釋測(cè)序得到的小RNA序列，肉雞骨骼肌中的miRNAs占小RNAs總數(shù)的80%以上，但是miRNAs只占小RNA種類的1%～2%。使用SOA

6、P軟件將已知序列同miRBase(Release15.0)中雞的miRNAs前體序列進(jìn)行比對(duì)，分別鑒定了198和179個(gè)保守的miRNA/miRNA*。使用Mireap軟件結(jié)果共發(fā)現(xiàn)28和17個(gè)新的候選miRNA/miRNA*。從以上miRNAs中共鑒定出57個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNAs。
　　 3、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)57個(gè)miRNAs中的6個(gè)表達(dá)上調(diào)(gga-let-7b、gga-miR-103、gga-miR-140

7、*、gga-miR-181a、gga-miR-206和gga-miR-30d)和2個(gè)表達(dá)下調(diào)(gga-miR-301b-3p和gga-miR-1682)的miRNA進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明所有miRNA的表達(dá)都差異顯著，這一結(jié)果同Solexa測(cè)序結(jié)果一致。
　　 4、miRNA主要通過(guò)與靶mRNA3’端非編碼區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，使靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯合成。通過(guò)生物信息學(xué)方法，我們預(yù)測(cè)了miRNA的靶基因，轉(zhuǎn)錄因子EIF

8、4E和胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF1)被預(yù)測(cè)為gga-miR-206的靶基因；胰島素生長(zhǎng)因子2mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)和磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞基3(PIK3R3)被預(yù)測(cè)為gga-miR-181a的靶基因；PIK3R3同時(shí)被預(yù)測(cè)為gga-miR-103的靶基因；PI3K相關(guān)激酶SMG1被預(yù)測(cè)為gga-miR-140*的靶基因。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的靶基因可能同相應(yīng)的miRNA一起對(duì)肉雞骨骼肌蛋白質(zhì)的合成發(fā)揮重要作用。
　　 本研究