REV感染SPF雞中IL-6、IL-18和IFN-γ的定量檢測(cè).pdf

1、白細(xì)胞介素6又稱B細(xì)胞刺激因子，是誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的必需因子之一，其分泌水平的高低可以反映機(jī)體的體液免疫功能。白細(xì)胞介素18又稱為γ-干擾素誘生因子，是一種具有多向和多層次免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。IFN-γ是一種免疫調(diào)節(jié)的多效性因子，哺乳動(dòng)物和禽IFN-γ被用作感染機(jī)體細(xì)胞介導(dǎo)免疫的指示器。
　　 當(dāng)前，免疫抑制病給我國集約化養(yǎng)雞業(yè)帶來了很大危害，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染后可導(dǎo)致體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的嚴(yán)重抑制已有很多報(bào)道

2、，了解免疫抑制機(jī)理并制定提高雞的免疫應(yīng)答策略正成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本研究以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒人工接種SPF雞造成的免疫抑制為模型，對(duì)ChIL-6、ChIL-18和ChIFN-γ在免疫抑制中可能發(fā)揮的作用進(jìn)行了初步探討。研究內(nèi)容主要包括三部分：
　　 1.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染SPF雞主要免疫器官中IL-18基因表達(dá)量的研究。為了研究ChIL-18基因在禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染SPF雞體

3、內(nèi)的表達(dá)水平，130只1日齡SPF雞隨機(jī)分為2組，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒處理組和生理鹽水對(duì)照組。每個(gè)處理組分別在感染后7、14、21、28、35、42和49d隨機(jī)取8只雞處死，迅速取脾臟、胸腺和法氏囊樣品用于RNA提取。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室已建立的SYBRGreenⅠ染料實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，比較處理組和對(duì)照組ChIL-18基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組脾臟、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平除感染后14

4、d脾臟外，在感染后7d、14d、2ld、28d、35d、42d和49d均顯著升高(P<0.05)。
　　 2.分別成功建立了檢測(cè)ChIL-6和ChIFN-γ的SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)GenBank上ChIL-6和ChIFN-γ基因的序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成各自特異引物，并以核糖體蛋白亞基4基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBRGreenⅠ染料以建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。將ChIL-6、ChIFN-γ與核糖

5、體蛋白亞基4部分基因克隆至pMD18-T載體上，以各陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果表明，該方法對(duì)ChIL-6和ChIFN-γmRNA的擴(kuò)增效率均為107％左右，線性范圍為10-2～10-6，相關(guān)系數(shù)為0.998以上，最低能檢出100拷貝/μL；從RNA提取到熒光定量PCR結(jié)束的檢測(cè)周期只需4h。本研究所建立的ChIL-6和ChIFN-γ基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短，為在轉(zhuǎn)錄水

6、平對(duì)ChIL-6和ChIFN-γ的定量分析奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染SPF雞主要免疫器官中IL-6和IFN-γ基因表達(dá)量的研究。為了研究ChIL-6和ChIFN-γ基因在禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染SPF雞體內(nèi)的表達(dá)水平，120只1日齡SPF雞隨機(jī)分為2組，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒處理組和生理鹽水對(duì)照組。每個(gè)處理組分別在感染后7、14、21、28、35、42和49d隨機(jī)取6只