雞IFN-α-IL-18酵母表達(dá)及其與中藥單體聯(lián)合抗IBDV作用的研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊?。↖BD）是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一種急性、高接觸性傳染病。近年來，由于超強毒株和變異株的出現(xiàn)，傳統(tǒng)疫苗的免疫效果已不盡理想，病發(fā)后的治療難度也隨之增強，因此，新型抗IBDV制劑的研究已成為當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)的關(guān)注熱點。本研究將雞的IFN-α和IL-18基因融合后于畢赤酵母中表達(dá)，通過對表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性檢測和抗IBDV中藥單體的篩選，研究重組雞IFN-α-IL-18融合蛋白、中藥單體以及二者聯(lián)合抗IBDV效果

2、和抗病毒機制，為研究抗IBDV新型制劑提供新的思路。
　　1.重組雞IFN-α-IL-18酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　為探討雞 IFN-α和 IL-18及其融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，本研究將雞 IFN-α、IL-18及其融合基因分別置于酵母表達(dá)載體pPICZ-αA的AOX1啟動子下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和 pPICZ-IFN-α-IL-18。將重組質(zhì)粒分別用Pme I酶切線性化，電轉(zhuǎn)入

3、X-33酵母感受態(tài)細(xì)胞中，以1％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot檢測表達(dá)蛋白。結(jié)果表明，在酵母培養(yǎng)上清液中存在分子量分別為22 KD、23 KD和43 KD的目的蛋白，且該蛋白具有良好的免疫原性。
　　2.重組雞IFN-α-IL-18融合蛋白的生物學(xué)活性研究
　　為探討雞 IFN-α-IL-18融合蛋白對雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及核因子κB（NF-κB）的影響。本研究應(yīng)用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗初步檢測重組雞 I

4、FN-α-IL-18融合蛋白的生物學(xué)活性，ELISA法測定淋巴細(xì)胞中總 NF-κB和細(xì)胞核中 NF-κB的含量。結(jié)果表明，表達(dá)的IFN-α-IL-18和IL-18蛋白均能明顯促進雞外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（ P<0.05）， IFN-α對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有促進作用，但總體差異不顯著（P>0.05）。與對照組相比，經(jīng)IFN-α-IL-18和IL-18作用的雞淋巴細(xì)胞中總NF-κB含量明顯增加（ P<0.05），細(xì)胞核中 NF-κB含量差異極顯著（

5、 P<0.01）， IFN-α作用的淋巴細(xì)胞中總 NF-κB含量與對照組相比差異不顯著（P>0.05），細(xì)胞核中NF-κB含量顯著增加（P<0.05）。IFN-α-IL-18及IL-18能夠明顯促進淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，IFN-α促進淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性較弱，這種促淋轉(zhuǎn)機制與 NF-κB的表達(dá)、活化及核質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)。
　　3.重組雞 IFN-α-IL-18融合蛋白的抗 IBDV效果研究及抗 IBDV中藥單體的篩選
　　為進一步探討重組雞I

6、FN-α-IL-18融合蛋白的抗IBDV活性并篩選出抗IBDV的中藥單體，本研究通過雞胚接種試驗對 IFN-α-IL-18及連翹苷元、黃芪苷、黃芩素、綠原酸、木犀草酸、馬錢酸6種中藥單體的抗 IBDV效果進行評價。結(jié)果表明，IFN-α-IL-18融合蛋白能夠顯著抑制 IBDV在雞胚中的增殖（P<0.01）， IFN-α和IL-18酵母表達(dá)產(chǎn)物對IBDV也有明顯的抑制作用（P<0.05）。六種中藥單體都能一定程度地發(fā)揮抗 IBDV活性，其

7、中，黃芩素和綠原酸作用極顯著（P<0.01）。
　　4.重組雞IFN-α-IL-18融合蛋白與中藥單體的聯(lián)合抗IBDV效果研究
　　為探索重組雞 IFN-α-IL-18融合蛋白與中藥單體的聯(lián)合抗 IBDV效果，本研究將篩選出的具有明顯抗 IBDV的中藥單體黃芩素和綠原酸，分別與不同濃度的重組雞IFN-α-IL-18蛋白進行組合，接種9日齡雞胚。IBDV抗原檢測結(jié)果表明，聯(lián)合使用黃芩素和重組蛋白 IFN-α-IL-18對 IB