IL-18和IL-18BP融合蛋白在不同載體中的表達(dá)和純化.pdf

1、白細(xì)胞介素18是白細(xì)胞介素1家庭的一位獨(dú)特的家族成員。它與白細(xì)胞介素1在結(jié)構(gòu)上很相似，都是需要caspase-1才能使之前體變成有活性的因子。IL-18作為一種細(xì)胞因子可以誘生IFN-γ、增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性作用、增強(qiáng)NK細(xì)胞活性、增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)、抗腫瘤作用等多種生物功能。白介素18結(jié)合蛋白(IL-18BF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，目前已發(fā)現(xiàn)有6種IL-8BP的同工蛋白。IL-18BP可以在體內(nèi)外有效抑制I

2、L-18的作用，因而被認(rèn)為是IL-18的天然拮抗劑。以往對(duì)IL-18和IL-18BP的研究分析只限于某個(gè)載體，沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)原核系統(tǒng)、沒(méi)有專(zhuān)門(mén)為了獲取融合性蛋白而進(jìn)行的。也沒(méi)有在誘導(dǎo)表達(dá)和純化的過(guò)程中，對(duì)IL-18和IL-18BP這兩個(gè)天然拮抗劑進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的統(tǒng)一的分析，沒(méi)有把他們的緩沖環(huán)境、融合蛋白誘導(dǎo)條件和洗雜、洗脫環(huán)境總結(jié)為共同的一個(gè)模式。IL-18和IL-18BP都存在于動(dòng)物體內(nèi)，因此對(duì)同一環(huán)境下的研究就顯得十分有意義。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)原核

3、系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)和純化，并以獲得融合蛋白為目的，不斷的探討能夠表達(dá)出融合蛋白的方法，同時(shí)對(duì)IL-18和IL-18BP表達(dá)、純化條件進(jìn)行比較，是一個(gè)縱向從PCR到純化，橫向從IL-18到IL-18BP的新的研究方法。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上雖然有一定程度的相似。但是還是相差很遠(yuǎn)，對(duì)它們表達(dá)和純化的共同模式的摸索可能對(duì)它們作用機(jī)理、在動(dòng)物體內(nèi)的相互作用制衡的研究提供幫助。IL-18BP是IL-18的天然拮抗劑，由于他們都具有免疫的雙向調(diào)節(jié)作用，所以在疾病

4、的過(guò)程中通過(guò)兩者的平衡，到達(dá)治療和預(yù)防疾病的作用，那么本次實(shí)驗(yàn)的研究可能會(huì)對(duì)二者在共同的環(huán)境一動(dòng)物體內(nèi)平衡的研究具有一定程度上的意義。同時(shí)也將為基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)免疫學(xué)提供新的科學(xué)研究依據(jù)，產(chǎn)生重要的影響。 實(shí)驗(yàn)研究采用PCR擴(kuò)增出人白細(xì)胞介素18和人白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白的DNA，克隆到原核表達(dá)載體PET28a和Pgex-6p-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在原核系統(tǒng)(BL21)中表達(dá)并純化人白細(xì)胞介素18和白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白

5、。探討了PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)和純化方面的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和注意事項(xiàng)，從而展示了原核表達(dá)系統(tǒng)從PCR到純化更加清晰的思路，同時(shí)也對(duì)蛋白序列進(jìn)行了一定的分析，通過(guò)分析得出消光系數(shù)等數(shù)據(jù)，再同層析系統(tǒng)所提供的數(shù)據(jù)結(jié)合，計(jì)算出了蛋白的濃度，最后將蛋白進(jìn)行濃縮，保存在-80℃。也從菌中提取了重組質(zhì)粒，保存起來(lái)，以便日后方便使用。 實(shí)驗(yàn)運(yùn)用gene runner軟件設(shè)計(jì)好了引物，根據(jù)基因的特點(diǎn)和性質(zhì)，選擇了BamH I和EcoRI兩個(gè)

6、酶切位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冇泄餐木彌_環(huán)境，進(jìn)而確定了PET28a和Pgex-6p-1作為載體。根據(jù)菌體的性質(zhì)，優(yōu)化了質(zhì)粒提取的效率。實(shí)驗(yàn)為了提高連接的效率，采用過(guò)夜連接，確保連接的成功。轉(zhuǎn)化過(guò)程避開(kāi)了震動(dòng)，熱擊時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等一系列的干擾因素，使得實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)嚴(yán)格控制時(shí)間，菌液的OD值等，避免了表達(dá)過(guò)程可能丟失重組質(zhì)粒、噬菌體干擾，其他菌類(lèi)的滋長(zhǎng)等情況的發(fā)生。對(duì)于最佳的誘導(dǎo)濃度的摸索，采用了縱橫交叉的梯度摸索，盡可能的找到誘導(dǎo)出融合

7、蛋白的條件。為了避免在上層析系統(tǒng)時(shí)RNA對(duì)吸收峰的影響和蛋白的降解，事先在緩沖液中加入了RNA酶和還原劑。根據(jù)層析系統(tǒng)所得到的信息，進(jìn)一步提純蛋白。白細(xì)胞介素18(IL-18)和白介素18結(jié)合蛋白(IL-18BP)的研究對(duì)腫瘤疾病、自身免疫性疾病感染性疾病、移植物抗宿主病、代謝綜合征、過(guò)敏性疾病的治療和它們的發(fā)病機(jī)理都有很大的幫助。純化出來(lái)的蛋白無(wú)論去做免疫活性的測(cè)定、單克隆抗體的制備，上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還是用于疾病的治療以及疾病