基于pLYCRISPR-Cas9-Mtdi載體系統(tǒng)的棉花多位點(diǎn)基因編輯研究.pdf

1、棉花是世界上主要的纖維作物，也是許多生物學(xué)過程研究中的模式系統(tǒng)。因此，提高棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)以及改良其他重要性狀一直是研究中的重中之重。近年來，棉花基因組學(xué)研究發(fā)展迅速，鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）以及最新的聚集的規(guī)律插入間隔回文重復(fù)（CRISPR／cas9）等一系列人工核酸內(nèi)切酶已經(jīng)成功應(yīng)用到多個(gè)物種的基因組編輯上?；蚓庉嬒到y(tǒng)可以切割特定的靶序列，在靶位點(diǎn)處造成雙鏈斷裂（DSBs），形成位點(diǎn)特

2、異的DNA序列修飾?；蚪M修飾類型包括序列的插入和缺失，非同源末端連接（NHEJ）引起的突變以及同源重組（HR）序列校正引起的突變。許多研究者利用CRISPR/cas9系統(tǒng)在多種生物體中進(jìn)行定點(diǎn)突變，探索并闡明基因的功能。然而，目前還沒有文章揭示基因組編輯技術(shù)在棉花上的應(yīng)用。在本研究中，我們利用CRISPR/cas9系統(tǒng)對亞洲棉（Gossypiumarboreum）的多個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，選定的3個(gè)靶標(biāo)基因分別為：著絲粒形成相關(guān)基因

3、CENH3、染色體凝縮配對相關(guān)基因RAD21以及多數(shù)真核細(xì)胞染色體交叉互換（CO）過程必需的基因DMC1。我們利用巢式PCR技術(shù)對多個(gè)sgRNA表達(dá)盒進(jìn)行快速擴(kuò)增，通過Golden Gate克隆法將多個(gè)sgRNA表達(dá)盒一次性組裝到CRISPR/Cas9雙元載體上。利用CRISPR/cas9系統(tǒng)，我們對棉花中靶基因的3個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，將成熟的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，利用PCR擴(kuò)增檢測靶位點(diǎn)處DNA的斷裂。通過聚丙烯酰胺凝