基于多位點(diǎn)Gateway技術(shù)的慢病毒載體構(gòu)建及其在胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)的主要研究思路是，首先是通過Gateway技術(shù)構(gòu)建系列的慢病毒質(zhì)粒(包括廣泛表達(dá)啟動(dòng)子和組織特異啟動(dòng)子兩種類型)；然后選取代表三胚層組織特異啟動(dòng)子的三種慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人和食蟹猴的胚胎干細(xì)胞，對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，對所得到的熒光細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分析；最后選取攜帶廣泛表達(dá)啟動(dòng)子的兩種慢病毒載體進(jìn)行小鼠iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的初步研究；因此，本研究主要分為以下四個(gè)部分：
　　 第一部分：利用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)構(gòu)建系列慢病毒載體。<

2、br>　　 第二部分：攜帶組織特異啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第三部分：慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)食蟹猴胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第四部分：攜帶廣泛表達(dá)啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞的初步實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第一部分利用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)構(gòu)建系列的慢病毒載體
　　 1.1目的:
　　 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建系列的慢病毒載體，通過病毒包裝技術(shù)

3、產(chǎn)生相應(yīng)的慢病毒，高速離心后對病毒進(jìn)行濃縮。目的在于通過操作簡便的Gateway技術(shù)快速、高效的構(gòu)建系列的慢病毒載體。
　　 1.2方法:
　　 1.2.1通過LR結(jié)合反應(yīng)，將攜帶報(bào)告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動(dòng)子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行連接，構(gòu)建2K7puro/promoter-reporter gene的表達(dá)載體。
　　

4、 1.2.2分別將表達(dá)載體質(zhì)粒與ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集及濃縮病毒。
　　 1.3結(jié)果:
　　 1.3.1將攜帶報(bào)告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動(dòng)子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行連接，構(gòu)建系列的2K7puro/promoter-reporter gene的表達(dá)載體

5、。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，得到單細(xì)菌克隆。
　　 1.3.2將2K7puro/promoter-reporter gene的表達(dá)載體與ViraPowerTM LentiviralPackaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細(xì)胞48h至72h后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光并有細(xì)胞融合現(xiàn)象，收集病毒上清液高速離心后，可見病毒顆粒沉淀在離心管底部。
　　 1.4結(jié)論:
　　 1.4.1成功構(gòu)建系列的2K7puro/

6、promoter-reporter gene的慢病毒表達(dá)載體。1.4.2利用2K7puro/promoter-reporter gene的表達(dá)載體在293FT細(xì)胞成功包裝產(chǎn)生慢病毒。
　　 第二部分?jǐn)y帶組織特異啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 2.1目的:
　　 選取攜帶代表三胚層組織特異啟動(dòng)子的2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP、2K7puro/aP2-hrGF

7、P和2K7puro/Albumin-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)人ES細(xì)胞，使用嘌呤霉素篩選后獲得攜帶不同外源基因的純化的人ES細(xì)胞，然后加入誘導(dǎo)試劑促進(jìn)人ES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，以獲得表達(dá)Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行相關(guān)的鑒定分析。
　　 2.2方法:
　　 2.2.1通過分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法分別將三種慢病毒載體導(dǎo)入人ES細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用1-5μg/ml嘌

8、呤霉素篩選14天以獲得帶有不同表達(dá)質(zhì)粒的純化的人ES細(xì)胞。
　　 2.2.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進(jìn)人ES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，以獲得表達(dá)Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行免疫組化和功能染色等的相關(guān)鑒定分析。
　　 2.3結(jié)果:
　　 2.3.1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)7天后，加入1-5μg/ml的嘌呤霉素開始篩選，可以觀察到有一定量的細(xì)胞死亡。篩選兩周后，可以得到抗嘌呤霉素的攜

9、帶外源質(zhì)粒的純化的人ES細(xì)胞。
　　 2.3.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進(jìn)人ES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，獲得了表達(dá)Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細(xì)胞，通過相關(guān)鑒定分析來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)Tα1-α-tubulin hESC的熒光細(xì)胞證實(shí)為神經(jīng)元。
　　 2.4結(jié)論:
　　 2.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人ES細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的人ES細(xì)胞經(jīng)過篩選獲得純化的細(xì)胞群，細(xì)胞生長和分化能力不受病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的

10、影響。
　　 2.4.2成功誘導(dǎo)攜帶含不同組織特異啟動(dòng)子慢病毒載體的人ES細(xì)胞分化為表達(dá)綠色熒光的特定細(xì)胞類型，為以后分化機(jī)理和移植治療的研究提供了很好的工具。
　　 第三部分慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)食蟹猴胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 3.1目的:
　　 選取攜帶代表三胚層組織特異啟動(dòng)子的2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP、2K7puro/aP2-hrGFP和2K7puro/Album

11、in-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)食蟹猴ES(cmES)細(xì)胞進(jìn)行純化后，然后加入誘導(dǎo)試劑促進(jìn)cmES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，以獲得表達(dá)Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行相關(guān)的鑒定分析。另外，通過體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)導(dǎo)2K7puro/EF1-α-hrGFP和2K7puro/EF1-α-dTomato的cmES細(xì)胞在體內(nèi)能夠分化為三胚層細(xì)胞類型。
　　 3.2方法:
　　 3.

12、2.1通過分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法分別將三種慢病毒載體導(dǎo)入cmES細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用1-5μg/ml嘌呤霉素篩選14天，以獲得帶有不同表達(dá)載體的純化的cmES細(xì)胞。
　　 3.2.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進(jìn)cmES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，以獲得表達(dá)Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行免疫組化和功能染色等的相關(guān)鑒定分析。
　　 3.2.3將1-2×107的hrGFP-cmES和dT

13、omato-cmES細(xì)胞注射到裸鼠背部皮F，2-3個(gè)月后處死并取出腫瘤，固定后送病理科石蠟切片檢查。部分組織做冰凍切片觀察腫瘤組織的熒光表達(dá)情況。
　　 3.3結(jié)果:
　　 3.3.1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)7天后，加入嘌呤霉素開始篩選，可以觀察到有一定量的細(xì)胞死亡。篩選兩周后，可以得到抗嘌呤霉素的攜帶外源質(zhì)粒的純化的cmES細(xì)胞。
　　 3.3.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進(jìn)cmES細(xì)胞向神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分化，獲得了表達(dá)Tα

14、1-α-tubulin和aP2的綠色熒光細(xì)胞，通過相關(guān)鑒定分析證實(shí)來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)Tα1-α-tubulin和aP2的熒光細(xì)胞為神經(jīng)元和脂肪細(xì)胞。
　　 3.3.1 hrGFP-cmES和dTomato-cmES細(xì)胞形成的腫瘤組織包膜完整，可觀察到三胚層來源的細(xì)胞類型。熒光顯微鏡下觀察可見腫瘤組織均一性表達(dá)綠色或紅色熒光，未見明顯的熒光衰減現(xiàn)象。
　　 3.4結(jié)論:
　　 3.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cmES細(xì)胞，經(jīng)過

15、篩選獲得純化的細(xì)胞群，細(xì)胞生長和分化能力不受病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。
　　 3.4.2成功誘導(dǎo)攜帶不同外源基因的cmES細(xì)胞分化為表達(dá)綠色熒光的特定細(xì)胞類型，為以后分化機(jī)理和移植治療的研究提供了很好的工具。
　　 3.4.1轉(zhuǎn)導(dǎo)后的cmES細(xì)胞在體內(nèi)仍然保持多向分化能力，而且報(bào)告基因的表達(dá)未發(fā)生明顯的衰減，說明hrGFP和dTomato是一種理想的體內(nèi)示蹤劑。
　　 第四部分：攜帶廣泛表達(dá)啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠iPS

16、細(xì)胞的初步研究
　　 4.1目的:
　　 首先通過對分子標(biāo)記的檢測和體內(nèi)外分化實(shí)驗(yàn)證明獲得的小鼠iPS細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能的特性。將2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)iPS細(xì)胞，用抗生素篩選后得到純化的表達(dá)dTomato和hrGFP的iPS細(xì)胞。目的在于證實(shí)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的慢病毒載體能夠有效的感染iPS細(xì)胞。
　　 4.2方法

17、:
　　 4.2.1 iPS細(xì)胞生物學(xué)特性的分析：對iPS細(xì)胞的分子標(biāo)記及體內(nèi)外分化能力進(jìn)行檢測。
　　 4.2.2分別利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)dTomato和hrGFP進(jìn)入iPS細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。
　　 4.2.3抗生素篩選純化轉(zhuǎn)導(dǎo)后的iPS細(xì)胞。
　　 4.3結(jié)果:
　　 4.3.1 iPS細(xì)胞生

18、物學(xué)特性：iPS細(xì)胞表達(dá)Oct4、SSEA-1,在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細(xì)胞類型。
　　 4.3.2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)48h后，熒光倒置顯微鏡下可見部分iPS細(xì)胞表達(dá)紅色熒光或綠色熒光?？股睾Y選7-14滅后，可得到表達(dá)dTomato和hrGFP的陽性iPS細(xì)胞克隆。
　　 4.4結(jié)論:
　　 4.4.1小鼠iPS細(xì)胞具有與小鼠ES細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。
　　 4.4.2成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)iPS細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后部分