基因修飾的胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建血管化心肌組織.pdf

1、心臟缺血性疾病具有很高的發(fā)病率和死亡率，是目前工業(yè)化社會人類死亡的首要原因。在全世界范圍內(nèi)，每年都有數(shù)萬人發(fā)生心肌梗死，導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞死亡，由于心肌細(xì)胞再生能力有限，盡管有良好的藥物治療，但仍會繼發(fā)心力衰竭。目前治療終末期心力衰竭患者的主要方法是植入左室輔助裝置(LeftVentdcular Assist Devices，VAD)或心臟移植。VAD主要用于預(yù)防左室重塑和擴(kuò)張，并不能從根本上改善心臟的收縮功能。而心臟移植卻受到移植器官來

2、源有限及移植后引發(fā)免疫排斥反應(yīng)等因素的限制。心肌組織工程是一門正在迅速發(fā)展的新興學(xué)科，它在體外將細(xì)胞與支架材料結(jié)合從而制造工程化心肌組織用于修復(fù)或再生受損心肌，為治療心臟缺血性疾病帶來了新的希望。但是，心肌細(xì)胞來源有限以及體內(nèi)移植后大量細(xì)胞或組織死亡，阻礙了這種策略的實際應(yīng)用。
　　 胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESC)具有多能性，可在體外無限增殖，又能分化為心肌細(xì)胞，是目前用于構(gòu)建工程化心肌組織最有前

3、途的細(xì)胞來源之一。ESC應(yīng)用于臨床的最大障礙之一就是其致瘤性。不僅是ESC的移植會導(dǎo)致腫瘤的生成，ESC來源的分化細(xì)胞移植也可能會有腫瘤形成的風(fēng)險。盡管報道了多種可使ESC分化為心肌細(xì)胞的方法，但ESC分化來的細(xì)胞中仍然含有大量的非心肌細(xì)胞及部分未分化的ESC。如何有效地獲取ESC來源的心肌細(xì)胞并去除未分化的ESC，是應(yīng)用ESC來源的心肌細(xì)胞構(gòu)建工程化心肌組織有待解決的難題。此外，體外構(gòu)建的工程化心肌組織由于缺乏血管網(wǎng)絡(luò)，其大小受到了限

4、制。大部分的心肌移植物都依賴于宿主發(fā)生血管化，對于更厚的組織來說，宿主自身的血管要經(jīng)過很長一段時間才能生長到移植物內(nèi)部，在這段時間內(nèi)由于不能提供移植物充足的毛細(xì)血管網(wǎng)，移植物中的細(xì)胞由于缺乏營養(yǎng)而發(fā)生凋亡或壞死，進(jìn)而影響心肌移植物發(fā)揮功能。針對心肌組織工程所面臨的上述問題，本研究采用基因修飾的手段賦予小鼠ESC及其衍生的心肌細(xì)胞特異性篩選標(biāo)記，使之易于純化ESC來源的心肌細(xì)胞以及有效去除未分化的ESC，在此基礎(chǔ)上，以液態(tài)膠原為支架體外構(gòu)

5、建高度血管化的心肌組織，探索基因修飾的ESC作為種子細(xì)胞構(gòu)建血管化心肌組織的可行性，相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見報道。
　　 我們以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到心肌a-MHC啟動子，將心肌a-MHC啟動子置換pcDNA3.1(+)-EGFP-hygro載體中的CMV啟動子，成功構(gòu)建出a-MHC-EGFP表達(dá)載體。通過電穿孔法將a-MHC-EGFP轉(zhuǎn)染原代小鼠心臟細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染陽性的心肌細(xì)胞發(fā)出綠色熒

6、光，而非心肌細(xì)胞沒有出現(xiàn)綠色熒光，證明我們構(gòu)建的a-MHC-EGFP表達(dá)載體具有心肌特異性表達(dá)特性。
　　 為了更容易地選擇ESC來源的心肌細(xì)胞，我們將EGFP篩選標(biāo)志替換為新霉素抗性基因，成功獲得心肌特異性表達(dá)載體pMHC-neo/SV40-hygro。將pMHC-neo/SV40-hygro載體轉(zhuǎn)染到小鼠ESC中，成功獲得了6株基因修飾小鼠ESC細(xì)胞系，其中一株ESC細(xì)胞系命名為MN6，不僅能穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因，而且增殖迅速且保

7、持未分化狀態(tài)。轉(zhuǎn)基因pMHC-neo/SV40-hygro的表達(dá)不影響ESC向心肌細(xì)胞分化，它們具有與野生型ESC相似的發(fā)育模式，能夠分化出自發(fā)跳動的心肌細(xì)胞。ESC分化培養(yǎng)物中的跳動區(qū)域呈肌鈣蛋白T染色陽性，并具有很好的空間相關(guān)性。基因修飾的ESC懸浮培養(yǎng)5天形成擬胚體(Embryoid Body，EB)，再經(jīng)抗壞血酸誘導(dǎo)12天后，加入G418篩選6天，選擇后的細(xì)胞99％以上表達(dá)心肌特異性標(biāo)志a-肌小節(jié)肌動蛋白。RT-PCR結(jié)果顯示，

8、G418選擇后的細(xì)胞中未檢測到Oct-4的表達(dá)，表明可能沒有未分化的ESC。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和超微結(jié)構(gòu)分析顯示，G418選擇后的心肌細(xì)胞能夠表達(dá)心肌特異性標(biāo)志，并具有發(fā)育良好的肌原纖維。
　　 對于潛在的實際應(yīng)用來說，需要建立一種可控的大規(guī)模生產(chǎn)ESC來源的心肌細(xì)胞的方法。我們嘗試采用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)基因修飾小鼠ESC，通過摸索基因修飾小鼠ESC不同接種密度及生物反應(yīng)器初始攪拌速度對EB形成的影響，以細(xì)菌培養(yǎng)皿常規(guī)靜

9、態(tài)培養(yǎng)的EB為對照，用抗壞血酸誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化，比較兩種培養(yǎng)體系對ESC向心肌細(xì)胞分化潛能的影響。與細(xì)菌培養(yǎng)皿相比，攪拌式生物反應(yīng)器能有效控制EB之間發(fā)生廣泛凝聚，EB形成的效率更高。當(dāng)ESC的接種密度為2×105個/ml，攪拌速度設(shè)定為25 rpm時，通過體外培養(yǎng)5天，攪拌式生物反應(yīng)器中可形成EB約482個/ml，EB大小相對均一，直徑為496土20μm。AO/PI和H&E染色結(jié)果顯示，攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的EB中細(xì)胞活力更好，沒

10、有出現(xiàn)中心壞死。攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)EB的心肌特異性基因的表達(dá)水平明顯增加，貼壁誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，EB能迅速貼壁生長出分化細(xì)胞，不僅出現(xiàn)跳動心肌細(xì)胞的EB數(shù)的百分比更高，而且EB分化細(xì)胞中a-肌小節(jié)輔肌動蛋白陽性的細(xì)胞百分比也更高。此外，攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的EB在G418選擇后獲得的心肌細(xì)胞相對產(chǎn)量也更高。
　　 內(nèi)皮毛細(xì)血管不僅可為心肌移植物提供氧氣和營養(yǎng)，而且內(nèi)皮與心肌細(xì)胞之間的相互作用對細(xì)胞的存活和增殖具有重要作用。我們以

11、基因修飾的小鼠ESC作為種子細(xì)胞，在攪拌式生物反應(yīng)器中大規(guī)模制備EB，采用抗壞血酸誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化，通過G418篩選ESC來源的心肌細(xì)胞，將富集的心肌細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)和胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEF)混合，以鼠尾液態(tài)膠原為支架在體外構(gòu)建高度血管化的心肌組織，并進(jìn)行初步的體內(nèi)移植研究。血管化

12、心肌組織中的細(xì)胞不僅排列致密均勻，而且凋亡細(xì)胞明顯減少，更類似于新生小鼠心肌的結(jié)構(gòu)特征。血管化心肌組織移植裸鼠皮下后四周，所有標(biāo)本均未觀察到腫瘤的形成，移植物中的細(xì)胞能夠存活。重要的是，HUVEC能促進(jìn)工程化心肌組織的血管化，而添加的MEF能進(jìn)一步支持內(nèi)皮細(xì)胞組裝到血管網(wǎng)絡(luò)中，使管腔的數(shù)量和面積有明顯的提高，因而能形成更厚的心肌組織。
　　 研究結(jié)果表明，基因修飾的小鼠ESC能夠作為構(gòu)建工程化心肌組織的種子細(xì)胞來源，采用基因修飾