cecropin B分泌型融合基因的構建及其轉化柑桔的研究.pdf

1、柑桔是世界最重要的商品水果之一,在所有水果種類中,其種植面積和產(chǎn)量均居第一位,是第五大國際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。在全球138個國家和地區(qū)栽培柑桔,是我國南方農(nóng)村的經(jīng)濟支柱。然而柑桔產(chǎn)業(yè)正面臨著各種病蟲害的威脅,其中,潰瘍病和黃龍病是柑桔產(chǎn)業(yè)中具有毀滅性危害的細菌病害,往往給柑桔產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此,解決柑桔病害成為柑桔產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵性因素,但目前世界柑桔生產(chǎn)中潰瘍病的危害仍然沒有克服,嚴重影響果實的品質和經(jīng)濟利益。
　　 本

2、實驗前期研究表明來自柞蠶的抗菌肽基因能顯著提高柑桔對潰瘍病細菌的抗性,并獲得了遺傳穩(wěn)定、抗性增加的轉基因柑桔植株。在此基礎上,本研究針對潰瘍病細菌細胞間隙寄生的特點,人工合成分泌型抗菌肽基因,利用農(nóng)桿菌介導將其轉入柑桔中,使抗菌肽基因在柑桔中分泌表達。為進一步有效利用抗菌肽基因改良柑桔抗病性提供一條新的思路和材料。取得的階段性結果如下:
　　 1.分泌型cecropinB基因的人工合成
　　 在參考大量國內(nèi)外文獻的基礎上

3、,選取了PR1a、aAM、GRP、PG、SPS、AAT等6個信號肽,通過生物信息學的分析,得到了四個具有潛在的分泌功能的信號肽,分別為PR1a、aAM、PG、AAT。從中選取了PR1a和AAT兩個信號肽序列,用于合成分泌型cecropinB基因。通過重組PCR成功獲得了PR1a:CB和AAT:CB兩個分泌型的cecropinB基因。
　　 2.分泌型cecropinB基因的亞細胞定位表達分析
　　 以紅色熒光蛋白基因rf

4、p為報告基因,構建用于抗菌肽基因亞細胞定位表達分析的植物表達載體,通過農(nóng)桿菌介導法轉化洋蔥上表皮細胞,熒光顯微鏡觀察抗菌肽基因的亞細胞定位表達情況。研究結果表明,PR1a和AAT信號肽均能高效促進抗菌肽基因的胞外分泌表達。
　　 3.超量表達抗菌肽基因植物表達載體的構建及柑桔的遺傳轉化
　　 以CaMV35S啟動子為抗菌肽基因的調控序列,構建了p35S-PR1a:CB、p35S-AAT:CB和p35S-CB植物表達載體,

5、并通過農(nóng)桿菌介導法將上述植物表達載體分別轉化錦橙,經(jīng)GUS染色和PCR技術篩選獲得了70余個轉基因株系。
　　 4.抗菌肽基因在轉基因植株中表達的qPCR分析
　　 分別從不同轉基因錦橙株系中提取總RNA,將其反轉錄為cDNA后,以actin為內(nèi)參、轉pGN的轉基因株系為空白對照,進行qPCR反應,對轉基因植株中CB基因的表達進行定量。結果表明,CB基因在轉PR1a:CB、AAT:CB和CB基因的轉基因株系中均有不同程度