Ve1-FG人工融合基因的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化擬南芥研究.pdf

1、小麥是世界性的糧食作物，全世界至少有35％的人口是以小麥為主要糧食的。小麥赤霉病是一種世界潮濕和半潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生的一種重要流行性病害。該病害不僅造成減產(chǎn)和品質(zhì)降低，致病菌所產(chǎn)生的赤霉菌毒素還會污染小麥病粒，嚴重影響食品安全和人畜健康?？钩嗝共∮N仍是控制小麥赤霉病的主要途徑。但小麥抗赤霉病育種仍然面臨著種質(zhì)資源相對匱乏、抗病品種農(nóng)藝性狀欠佳及育種周期漫長等困難。
　　 通過植物基因工程可有針對性的將抗病相關(guān)基因?qū)敫胁∑贩N中改

2、良其抗病性，轉(zhuǎn)基因工程株可以在保持原有受體品種的農(nóng)藝性狀的基礎(chǔ)上提高抗病性。因此，本研究試圖利用野生番茄上的抗黃萎病基因(Ve1)和小麥赤霉病的病原菌自身識別基因進行人工重組，并通過誘導表達和Western雜交，以驗證人工重組基因是否正確表達，為后續(xù)在植物體內(nèi)測試重組基因的功能奠定基礎(chǔ)，探索抗病新策略。取得以下主要研究結(jié)果:
　　 根據(jù)在番茄上已經(jīng)克隆到的抗黃萎病基因(Ve1)的序列，進行結(jié)構(gòu)域分析，推測Ve1基因1525-18

3、20nt為抗病識別區(qū)域;該識別區(qū)域與所抗目標病害黃萎病原菌基因組識別蛋白基因VDBG-096011465-1755nt區(qū)間，一致性為21％（61％為陽性）。小麥赤霉病原菌基因組內(nèi)存在與VDBG-09601同源的基因FGSG08285，一致性達55％（陽性率69％），但在上述識別區(qū)域內(nèi)無相似性。本研究通過融合Ve1基因及FGSG_08285基因，以期實現(xiàn)改造后的Ve1基因能夠識別小麥赤霉病菌從而達到抗病的全新策略。為了構(gòu)建該融合基因，擴增

4、出Ve1基因1-1524nt和1821-3159nt兩個片段以及小麥赤霉病FGSG_08285基因1561-1857nt片段，三個片段大小分別為1524bp，1338bp，297bp。通過Fusion PCR方法構(gòu)建Ve1-FGSG08285（簡稱Ve1-FG）融合基因，全長為3159bp。經(jīng)融合蛋白誘導表達及Western雜交，結(jié)果表明該融合基因與非融合Ve1基因一致，具有表達活性，為可溶性蛋白，表達產(chǎn)物大小為117KDa，為后續(xù)基因

5、抗病功能測試奠定基礎(chǔ)。利用半定量RT-PCR對該基因的組織表達特異性進行分析，表明Ve1-FG在根和莖中表達量較高，在葉中和果實中表達量較低。
　　 構(gòu)建植物表達載體pCXSN-Ve1-FG，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥;通過潮霉素抗性、PCR及RT-PCR篩選鑒定擬南芥植株，初步證明外源基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中。對轉(zhuǎn)基因擬南芥苗進行抗病性分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥對禾谷鐮刀菌的抗病性比對照植株強。轉(zhuǎn)基因擬南芥苗和