甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標(biāo)基因篩選和風(fēng)險評估.pdf

1、甜菜夜蛾（SpodopteraexiguaHubner），是一種危害嚴(yán)重的世界性害蟲。研究表明，通過dsRNAs或siRNAs沉默害蟲的重要基因是一種可行的害蟲防治方法，RNAi介導(dǎo)的害蟲控制的第一步是篩選出合適的靶標(biāo)基因。為了研究RNAi技術(shù)在甜菜夜蛾控制中的應(yīng)用，本論文首先根據(jù)基因在細(xì)胞代謝過程中的重要性，從甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出9個基因，研究了這些基因被干擾后對甜菜夜蛾的致死效果，同時開展了脫靶效應(yīng)檢測和安全性評估，為安全有效

2、地利用RNAi技術(shù)進(jìn)行甜菜夜蛾防治提供了依據(jù)。
　　1.甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標(biāo)基因全長克隆
　　根據(jù)玉米根葉甲中已知的害蟲控制靶標(biāo)基因和基因在細(xì)胞代謝過程中的重要性，從甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，篩選出9條甜菜夜蛾RNAi害蟲控制靶標(biāo)基因，分別為ADP-ribosylationfactor1(arf1),ADP-ribosylationfactor2(arf2),tubulin1,tubulin2,chitinase1

3、,chitinase7,plasmaglutamatecarboxypeptidase(PGCP),helicase和ATPase基因。利用RACE技術(shù)，成功克隆得到6個基因(arf1，arf2，tubulin2，chitinase7，PGCP，helicase)的5'UTR，但只克隆得到arf2基因的3'UTR。將5'UTR、3'UTR序列與轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行拼接，其中5個基因(arf1，arf2，tubulin2，chitinase7，

4、helicase)有完整的CDS區(qū)，arf2基因得到全長。9條基因與其他昆蟲物種的同源基因具有很高的相似性，并已將9條基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫。
　　2.甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標(biāo)基因RNA干擾
　　根據(jù)9條基因的序列，設(shè)計siRNA，將2μlsiRNA（2μg/μl）注射到4齡幼蟲體內(nèi)進(jìn)行RNA干擾，利用qRT-PCR檢測RNAi的效率。結(jié)果顯示，與對照相比，靶標(biāo)基因的mRNA豐度均有不同程度的下降(～20％-

5、94.3％)。同時8個基因(chitinase7，PGCP，chitinase1，ATPase，tubulin1，arf2，tubulin2和arf1)在被干擾后，死亡率顯著升高，其中PGCP-siRNA，chitinase1-siRNA，tubulin1-siRNA，tubulin2-siRNA和helicase-siRNA實驗組中約80％的存活個體出現(xiàn)發(fā)育遲緩，chitinase1-siRNA和chitinase7-siRNA實驗組

6、中12.5％的存活個體出現(xiàn)半蛻皮現(xiàn)象，arf1-siRNA和arf2-siRNA實驗組中15％的存活個體在注射siRNA48h后出現(xiàn)體色變黑的現(xiàn)象。
　　3.甜菜夜蛾RNAi脫靶分析
　　根據(jù)甜菜夜蛾RNAi實驗，選取chitinase1和arf2基因分別進(jìn)行了RNAi脫靶效應(yīng)分析。在分別沉默chitinase1和arf2基因后，對其進(jìn)行DGE(DigitalGeneExpressionProfiling)分析和qRT-PC

7、R檢測。主要檢測了三類非靶標(biāo)基因，第一類是與chitinase1和arf2基因的siRNA有不同連續(xù)匹配的非靶標(biāo)基因，第二類是與chitinase1、arf2基因同源的非靶標(biāo)基因，第三類是chitinase1、arf2基因所涉及的代謝通路中的其它基因，結(jié)果顯示這三類非靶標(biāo)基因的表達(dá)量均有小部分發(fā)生顯著性上調(diào)或下調(diào)，第一和第二類可能是由于脫靶效應(yīng)引起的，但第三類可能是代謝通路中的目標(biāo)基因被干擾后的連鎖反應(yīng)。
　　4.甜菜夜蛾siRN