雙親性修飾的殼聚糖納米口服疫苗運(yùn)送載體的構(gòu)建與性質(zhì)研究.pdf

1、近幾十年來(lái),密集型鯉魚(yú)養(yǎng)殖在中國(guó)已成為一個(gè)關(guān)鍵的行業(yè)。如果在養(yǎng)殖過(guò)程中，水體被氣單胞菌屬感染,鯉魚(yú)將會(huì)大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此有必要對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行保護(hù)性免疫處理。目前，人類已經(jīng)發(fā)展了許多技術(shù)來(lái)提高口服疫苗傳輸，納米顆粒因其可以有效的防止活性物質(zhì)降解、提高藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及可控釋放等優(yōu)點(diǎn)而備受人們關(guān)注。此外，納米材料的黏膜粘附性在其作為口服疫苗輸送系統(tǒng)的方面也尤為重要。材料的黏膜粘附性可以延長(zhǎng)藥物載體在胃腸道的滯留時(shí)間，增加藥物與黏膜

2、層的接觸機(jī)會(huì)，從而提高藥物滲透率，并且減少藥物的降解。
　　對(duì)殼聚糖進(jìn)行雙親性修飾，制備中性條件下可溶的油酰羧甲基殼聚糖(OCMCS)。紅外、核磁檢測(cè)證實(shí)了油酰基和羧甲基側(cè)鏈成功連接在殼聚糖上，元素分析結(jié)果表明油酰基側(cè)鏈及羧甲基側(cè)鏈的取代度分別約為5％和70%，通過(guò)芘熒光探針?lè)y(cè)定OCMCS的臨界聚集濃度為0.021 mg/ml，說(shuō)明在高于此濃度下，OCMCS溶液中有穩(wěn)定的疏水微區(qū)形成。以FITC為熒光標(biāo)記，共價(jià)修飾OCMCS主鏈

3、上(FITC-OCMCS)，可以對(duì)該載體材料定位示蹤。
　　采用膠質(zhì)凝聚法制備三種不同分子量的OCMCS納米顆粒，平均粒徑是150–350nm，zeta電位是10-20mV，透射電鏡觀察納米粒均為完整的球形。紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)表明，OCMCS納米顆粒的溶血率很低，符合生物醫(yī)用材料對(duì)溶血率的要求。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米材料沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，體內(nèi)的毒性試驗(yàn)表明，納米材料不會(huì)引起明顯的組織學(xué)病變。以上結(jié)果表明，OCMCS納米顆?？梢宰鳛橐?/p>

4、種安全的口服藥物運(yùn)輸載體。
　　以FD4為熒光標(biāo)記，同時(shí)作為一種大分子藥物模型，制備FD4-OCMCS納米顆粒。FD4-OCMCS納米顆粒可以有效的吸附于離體鯉魚(yú)腸粘膜表面，吸附量隨殼聚糖分子量的增加而增加。與FD4溶液相比，OCMCS納米顆粒將FD4跨腸粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效率提高到3.26-6.52倍，OCMCS納米顆粒與Caco-2細(xì)胞致密單層相互作用，降低細(xì)胞單層的跨膜電阻，并且將FD4的表觀滲透系數(shù)提高了3.61-6.32倍。

5、r>　　FITC-OCMCS納米顆粒對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行口服給藥，3天后，在鯉魚(yú)的肌肉、心臟、腎臟、肝臟、腸及脾臟等組織中均可檢測(cè)到熒光納米顆粒，對(duì)各組織中的熒光納米顆粒進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，肝臟、腎臟及脾臟中的熒光納米顆粒的量分別為34.32%、18.79%和17.36%。其中肝臟中熒光納米顆粒的量最低。
　　維氏氣單胞菌的細(xì)胞外產(chǎn)物(ECPs)氣溶素作為細(xì)菌抗原被有效包載制備OCMCS-ECPs納米顆粒, OCMCS-ECPs納米顆粒

6、在PBS中穩(wěn)定可以穩(wěn)定的釋放其包載的ECPs。選擇OCMCS-ECPs納米顆粒和ECPs溶液分別對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行口服免疫，免疫3次后，用OCMCS-ECPs處理的鯉魚(yú)血清中可以檢測(cè)到顯著增強(qiáng)的特異性抗體。
　　在 OCMCS納米顆粒中引入透明質(zhì)酸(HA)制備基因納米載體(OCMCS-HA/DNA)，對(duì)納米顆粒的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在N/P為5，OCMCS/HA(w/w)為4時(shí)，可以制備獲得顆粒最小，表面帶正電荷，顆粒形狀均一的

7、納米顆粒。由于HA的引入，OCMCS-HA/DNA納米顆粒表現(xiàn)出更高的DNA釋放量，并且更有利于被 Caco-2細(xì)胞吞噬。OCMCS-HA/DNA納米顆粒對(duì)于綠色熒光蛋白基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率是OCMCS/DNA的5倍，加入游離的HA后，OCMCS-HA/DNA納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率明顯下降。結(jié)果表明，OCMCS-HA/DNA納米顆粒的細(xì)胞吞噬是由Caco-2細(xì)胞表面的CD44受體介導(dǎo)。
　　將氣溶素的編碼基因aerA載入OCMCS-HA納

8、米顆粒，凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明納米顆?？梢杂行У匚桨麯NA，通過(guò)雙敏切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了被包裹DNA的穩(wěn)定性和完整性。利用透析法研究了OCMCS-HA/aerA、OCMCS/aerA兩種納米粒對(duì)于DNA的釋放效果，在pH6.0緩沖溶液中，兩種納米粒對(duì)DNA的釋放都比較緩慢，20h內(nèi)OCMCS-HA/aerA和OCMCS/aerA的累積釋藥量分別為12.4%和10.2%；當(dāng)改變釋藥介質(zhì)的pH至7.4后，原本達(dá)到釋藥平衡的納米粒又在10小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)明顯

9、的突釋現(xiàn)象，在隨后的20 h繼續(xù)緩釋，50 h內(nèi)OCMCS-HA/aerA和OCMCS/aerA的累積釋藥量分別為77.4%和31.4%，結(jié)果表明兩種納米顆粒都適合在腸道的中性pH下釋放DNA，并且OCMCS-HA/aerA納米顆粒有較高的釋放量。
　　本論文在殼聚糖的基礎(chǔ)上，雙親性修飾得到一種水溶性的油酰羧甲基殼聚糖來(lái)制備口服疫苗載體，通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了該載體材料的黏膜粘附性，通透性及生物安全性，通過(guò)對(duì)蛋白類疫苗和基因疫苗