殼聚糖-基因疫苗納米顆粒的制備與作用研究.pdf

1、基因治療和基因免疫是將表達(dá)目的蛋白的基因構(gòu)件直接注入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行疾病治療和免疫預(yù)防的一種方法，對(duì)遺傳性疾病、腫瘤和復(fù)雜傳染病的預(yù)防和治療具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。而基因遞送載體的構(gòu)建和改進(jìn)，一直是基因治療和基因免疫研究的重點(diǎn)。在臨床應(yīng)用上，目前廣泛使用的病毒載體所存在的潛在性安全性問題不斷引起人們的擔(dān)憂，因此非病毒性載體的基因轉(zhuǎn)移運(yùn)載體系的研發(fā)開始成為新的研究熱點(diǎn)。 殼聚糖是天然的陽離子多糖，作為基因轉(zhuǎn)移的非病毒型載體時(shí)，可以與帶負(fù)電荷的

2、質(zhì)粒DNA相結(jié)合，對(duì)DNA有很好的結(jié)合和保護(hù)作用，并使其可吸附于表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞，從而利于所包裹的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入吸附的細(xì)胞。殼聚糖在體內(nèi)可被機(jī)體消化吸收，具有生物可降解性、生物相容性和低毒性等良好的生物學(xué)特性，是自然界中不可多得的天然高分子載體材料。 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)殼聚糖在對(duì)質(zhì)粒疫苗的包裹特性，使用硫酸鈉鹽誘導(dǎo)的復(fù)凝聚法制備出殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所制備的顆粒近似球形，大小均一，直徑為40-80nm。

3、對(duì)所制備的殼聚糖納米顆粒進(jìn)行了對(duì)質(zhì)粒DNA的包封率、體外釋放情況、對(duì)所包裹的質(zhì)粒DNA的DNaseI的酶保護(hù)性以及顆粒的穩(wěn)定性等理化特性方面的初步的研究，結(jié)果顯示殼聚糖納米顆粒對(duì)質(zhì)粒DNA的包裹率接近100％，可抵抗DNaseI的降解，殼聚糖納米顆在體外的自身釋放緩慢，即穩(wěn)定性高，可在-20℃長(zhǎng)期保存，對(duì)保存條件要求不高。 本研究應(yīng)用含不同報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA，經(jīng)殼聚糖包裹成納米顆粒后注射小鼠，分別針對(duì)體內(nèi)表達(dá)和基因免疫水平進(jìn)行

4、初步研究，對(duì)殼聚糖納米顆粒介導(dǎo)的基因表達(dá)和基因免疫進(jìn)行了研究，同時(shí)用人工合成的陽離子多聚物乙酰亞胺(PEI)基因遞送載體作為比較。將包裹了含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的pEGFP-N1質(zhì)粒的殼聚糖納米顆粒溶液轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后可觀察到發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，表達(dá)可維持至8d后，且于-20℃保存了1個(gè)月的仍具有轉(zhuǎn)染能力；PEI介導(dǎo)的表達(dá)量高于殼聚糖/質(zhì)粒DNA顆粒，但其表達(dá)維持的時(shí)間短于殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒溶液組。在體內(nèi)表達(dá)時(shí)，

5、發(fā)現(xiàn)殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒盡管初使表達(dá)水平低于PEI介導(dǎo)的水平，但其表達(dá)所維持的時(shí)間卻長(zhǎng)于PEI的時(shí)間，且表達(dá)量呈現(xiàn)出穩(wěn)定的緩慢增高的趨勢(shì)，體現(xiàn)了殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒緩釋的特點(diǎn)。殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒作為基因疫苗的遞送載體時(shí)，能使機(jī)體產(chǎn)生很高的免疫應(yīng)答和抗體的效價(jià)，其效果顯著，好于PEI介導(dǎo)產(chǎn)生的免疫水平。 本研究結(jié)果表明，殼聚糖/質(zhì)粒DNA納米顆粒具有傳遞質(zhì)粒DNA進(jìn)入機(jī)體，允許基因緩慢釋放，有效地使基因長(zhǎng)期表達(dá)