利用cDNA捕捉法和抑制差減雜交方法克隆小麥抗病基因相關(guān)片段.pdf

1、小麥黃矮病是由大麥黃矮病毒引起的小麥嚴(yán)重病害之一.小麥中缺乏良好的抗源.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所綜合利用生物技術(shù)選育了抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系YW642,研究表明從中間偃麥草獲得的抗黃矮病基因?yàn)轱@性單基因,該基因被命名為Bdv2.克隆抗黃矮病基因?qū)ρ芯恐参锟共》肿訖C(jī)制和培育抗病品種有著非常重要的作用.該研究嘗試?yán)胏DNA捕捉法、抑制差減雜交方法以及篩選抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系YW642可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)基因組文

2、庫(kù)分離、克降小麥外源抗黃矮病基因相關(guān)片段.利用集群內(nèi)刪除方法,從抗黃矮病小麥易位系YW642噬菌體cDNA文庫(kù)中制備了質(zhì)粒cDNA文庫(kù),從質(zhì)粒cDNA文庫(kù)中制備了總單鏈質(zhì)粒DNA.根據(jù)抗病基因NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,利用Genetrapper<'(R)> cDNA Posistive SelectionSystem(Invitrogen<'TM>)篩選抗黃矮病小麥易位系cDNA文庫(kù),對(duì)文庫(kù)中含有抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的cDNA克隆

3、進(jìn)行富集,得到3 000個(gè)單克隆.以P1、P2為引物通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆,從450個(gè)單克隆中篩到3個(gè)陽(yáng)性單克隆.提交GenBank進(jìn)行Blast序列比對(duì),結(jié)果表明:克隆4-1與面包小麥的泛素cDNA同源性很高,克隆4-2與豌豆異戊酰輔酶A脫氫酶基因mRNA具有較高的同源性,克隆5-3與RubisCOcDNA高度同源.以YW642/中8601的F<,2>代純合的抗病和感病單株各10株提取DNA構(gòu)建成近等基因池,以抗病池為試驗(yàn)方,以感

4、病池為驅(qū)動(dòng)方,進(jìn)行抑制差減雜交(SSH),構(gòu)建差減文庫(kù),文庫(kù)包含960個(gè)克隆,插入片斷100bp~1200bp,平均插入片斷為350bp.利用正向抑制差減雜交和反向抑制差減雜交的產(chǎn)物為探針進(jìn)行差異篩選排除假陽(yáng)性,從192個(gè)克隆中得到8個(gè)陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性率為4.2％.經(jīng)Southern雜交驗(yàn)證,其中克隆TSH-1具有抗病池特異性,且為寡拷貝或單拷貝序列.經(jīng)測(cè)序,TSH-1長(zhǎng)388bp,提交GenBank進(jìn)行Blast比對(duì),沒(méi)有找到與之同源的