TcLr35小麥抗病相關基因的克隆及分析.pdf

1、植物抗病基因克隆研究對于抗病育種和抗病機制的理解具有重要意義。而小麥不僅基因組龐大(1.6×1016bp)，相當于水稻基因組的近40倍，且重復序列含量豐富，這些特點使尋找小麥抗病基因區(qū)段兩側(cè)的分子標記比較困難，增加了染色體步移或重疊克隆群構(gòu)建的難度。抗病基因同源片段的克隆，定位及其與已知抗病基因的連鎖分析，為克隆小麥抗病基因提供了新的思路。本論文根據(jù)已克隆的植物抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設計引物，采用同源克隆技術(shù)，并結(jié)合cDNA末端快速擴增(r

2、apidamplificationcDNAend，RACE)和熱不對稱交錯PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL-PCR)技術(shù)對小麥抗病基因同源序列進行了研究。同時，利用RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)和RACE技術(shù)篩選TcLr35小麥病程相關蛋白基因cDNA全長。主要研究結(jié)果如下： (1)根據(jù)抗病基因核苷酸結(jié)合位點(nucleotidebindingsite

3、，NBS)、富含亮氨酸重復(Leucine-richrepeats，LRR)保守結(jié)構(gòu)域設計引物，從攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系TcLr35中獲得了4個通讀的小麥抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2、S2A2和LRR1。其中3個片段含有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域，與已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相應區(qū)域相一致，具有抗病基因NBS特征結(jié)構(gòu)域(P環(huán)、激酶2a、激酶3a等)。LRR1含有3個完整的LRR重復單元，

4、與水稻抗白葉枯病基因Xa21基因具有較高同源性。 (2)以S2A2為靶序列，利用RACE技術(shù)獲得了cDNA全長2693bp的TcLr35小麥抗病相關基因，該基因包含1887bp的開放閱讀框，230bp的5’非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)，533bp的3’非翻譯區(qū)和21bp的多聚腺苷酸尾。在233bp處有ATG起始密碼子，2117bp處有TAG終止密碼子，編碼628個通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列，基因編碼產(chǎn)物具

5、有NBS、LRR等抗病基因保守結(jié)構(gòu)域。初步認為S2A2基因為CC-NBS-LRR類抗病相關基因。在GenBank獲得的登錄號為DQ205351。利用半定量RT-PCR技術(shù)對該基因的表達情況研究表明，S2A2基因為低豐度組成型表達，其表達不受病原菌接種的誘導。 (3)利用熱不對稱交錯PCR技術(shù)獲得了2個Lr35相關基因組DNA片斷RGA1的側(cè)翼序列，長度分別為511bp和614bp，與RGA1重疊區(qū)分別為293bp和509bp，分

6、別向3’端和5’端延長了208bp和100bp，拼接后序列為915bp。經(jīng)BLASTn同源性比較，與小麥抗葉銹病基因Lr21同源性為93﹪(score值為674，E值為0.0)，與含有Lr10基因的450kb大片斷重疊群同源性為90﹪(score值為260，E值為7e-66)。 (4)根據(jù)已發(fā)表的植物病程相關蛋白1基因和β(1，3；1，4)葡聚糖苷酶基因設計引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從被小麥葉銹菌誘導的小麥抗葉銹病近

7、等基因系材料TcLr35中獲得2個病程相關蛋白基因cDNA全長。其中，756bp的小麥病程相關蛋白1基因PR12包含495bp的開放讀碼框，147bp的5’非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)，155bp的3’非翻譯區(qū)和21bp的多聚腺苷酸尾。編碼164個通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列，基因產(chǎn)物具有植物防御體系中病程相關蛋白SCP保守結(jié)構(gòu)域，與GenBank中多個植物病程相關蛋白1基因具有較高的同源性。Southern雜交顯

8、示，該基因在TcLr35小麥基因組中為單拷貝。PR34cDNA全長序列為1340bp，具有一個編碼303個氨基酸的開放閱讀框(ORF)，其起始密碼子ATG位于77bp處，終止密碼子TAG位于988bp處，3’末端有29bp的poly(A)尾，323bp的3’非翻譯區(qū)。與GenBank中小麥、大麥等多個葡聚糖苷酶基因具有較高同源性；對其推斷的氨基酸序列進行分析，含有Glyco_hydro_17保守結(jié)構(gòu)域，為葡聚糖苷酶基因蛋白結(jié)構(gòu)域。Sou