類(lèi)甜蛋白基因參與TcLr35小麥成株抗葉銹病反應(yīng)的功能分析.pdf

1、類(lèi)甜蛋白（Thaumatin-like protein，TLP）是一類(lèi)具有多種生物學(xué)活性及重要功能的植物防御蛋白，在植物抗病防御反應(yīng)中起著重要的作用。為此，在前期研究基礎(chǔ)上，現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證已克隆類(lèi)甜蛋白基因TaLr35PR5參與Lr35基因介導(dǎo)的成株抗葉銹病防御反應(yīng)的功能。首先，SignalP4.0預(yù)測(cè)TaLr35PR5蛋白的前20個(gè)氨基酸是典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，推測(cè)TaLr35PR5蛋白可能是胞外蛋白，并通過(guò)酵母信號(hào)肽分泌系統(tǒng)加以驗(yàn)證;同時(shí)

2、，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對(duì)該基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析;利用VIGS技術(shù)進(jìn)一步明確該基因在小麥抗葉銹病防御反應(yīng)中的功能。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.克隆TaLr35PR5基因信號(hào)肽，并構(gòu)建酵母信號(hào)肽誘捕重組載體pSUC2-TaLr35PR5，將其轉(zhuǎn)化至酵母缺陷型菌株YTK12，在雙糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)酵母對(duì)雙糖的利用情況來(lái)鑒定信號(hào)肽的分泌功能。含有pSUC2-TaLr35PR5的酵母克隆可以在蔗糖與棉籽糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并

3、且能與TTC產(chǎn)生顏色反應(yīng)，表明TaLr35PR5信號(hào)肽具有分泌活性。
　　2.利用基因槍法將重組載體pCamA-TaLr35PR5-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行融合蛋白的亞細(xì)胞定位，以pCamA-GFP為對(duì)照。熒光顯微鏡下觀(guān)察到對(duì)照蛋白在整個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)，而融合蛋白明顯分布在胞外區(qū)域，推斷該蛋白可能是通過(guò)信號(hào)肽分泌到胞外來(lái)執(zhí)行其防御功能。
　　3.采用BSMV-VIGS技術(shù)對(duì)TaLr35PR5基因進(jìn)行功能分析。接種攜帶沉默基