一個新的小麥富半胱氨酸受體激酶基因在抗葉銹病中的功能研究.pdf

1、植物富半胱氨酸受體蛋白激酶屬于植物類受體蛋白激酶家族，關于該家族在小麥中的研究報道還很少。本試驗以小麥近等基因系TcLr26和Thacher（以下簡稱Tc）分別與葉銹菌生理小種260組成不親和與親和組合，在不親和組合中表現(xiàn)典型的細胞過敏性死亡(hypersensitive reaction，HR)現(xiàn)象。基于本實驗室對該互作體系的RNA-Seq高通量測序數(shù)據(jù)庫，通過基因差異表達分析，篩選到了一個在接種后較0h表達明顯上調(diào)的Unigene(

2、GeneID:CL13444.Contig1_All)，運用PCR技術結合RACE技術從TcLr26中克隆得到其CDS全長。通過生物信息學及系統(tǒng)進化樹分析，將該基因命名為TaCRK2。利用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)對TaCRK2基因在TcLr26接種葉銹菌后的表達模式進行了初步分析，結果顯示該基因在接種后呈持續(xù)上調(diào)表達趨勢，意味著TaCRK2基因與TcLr26抵抗葉銹菌的侵染過

3、程有密切關系。采用VIGS和RNAi技術對TaCRK2基因在TcLr26抵抗葉銹菌小種260侵染誘發(fā)的HR中的作用進行了研究，并通過幼穗轉(zhuǎn)化法獲得在Tc中過表達TaCRK2基因的陽性株系，接種試驗證明了該基因的過表達提高了Tc的抗葉銹性。本試驗獲得的主要結果如下:
　　1.利用PCR和5'RACE技術從近等基因系TcLr26中克隆得到TaCRK2的CDS全長。該基因全長1482bp，編碼493個氨基酸，其蛋白包含一個信號肽，胞外有

4、兩個CRKs家族典型的DUF26結構域（即兩個C-X8-C-X2-C基序），一個跨膜結構域和一個絲/蘇氨酸蛋白激酶結構域。
　　2.利用RT-qPCR檢測了不同親和性組合中TaCRK2基因的表達模式，結果顯示該基因在不親和組合中自接種后8h呈持續(xù)上調(diào)的表達趨勢，至48h其表達量達到了0h的9.45倍;而親和組合中，TaCRK2的表達量在0-48h幾乎沒有變化。初步證明TaCRK2基因參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的過程。
　　3.

5、利用VIGS技術和RNAi技術沉默TcLr26中的TaCRK2基因后再接種葉銹菌小種260，結果表明，在單侵染點處發(fā)生HR的細胞面積和吸器母細胞(haustorialmother cell，HMC)的數(shù)量較對照增多，接種后15天左右可在葉片表面觀察到葉銹菌的夏孢子堆，且RNAi植株葉片上出現(xiàn)的孢子堆數(shù)量也較VIGS葉片多。另外，還發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)化植株在接種后24h HR細胞才剛剛出現(xiàn)，相比未轉(zhuǎn)化植株延遲了8～12h。這些結果表明，TaC

6、RK2基因在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的過敏性反應中起到了重要的正調(diào)控作用，TaCRK2基因的沉默降低了TcLr26對葉銹菌的抗性。
　　4.構建了TaCRK2基因的過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的幼穗法轉(zhuǎn)化體系對Tc進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得陽性過表達植株。在T1代TaCRK2過表達植株上接種葉銹菌小種260，在侵染點處或非侵染點處均可觀察到HR，同時發(fā)現(xiàn)菌的發(fā)育受到極大限制，接種后15天左右在葉片上沒有出現(xiàn)葉銹菌的夏孢子堆。由此可見，TaCRK2

7、基因的過表達大大提高了Tc對葉銹菌的抗性。
　　5.對小麥TcLr26外源噴施SA后，TaCRK2基因被大量誘導表達，說明TaCRK2基因可能參與了SA信號通路，并在SA信號下游發(fā)揮作用。
　　6.不同近等基因系接種葉銹菌小種260后，TaCRK2基因在三個不親和組合中（TcLr1、TcLr19和TcLr21接種葉銹菌小種260）12h之前的表達量呈逐漸增加趨勢，且在8h或12h出現(xiàn)表達高峰，表達量達到0h的4倍至20多倍不

8、等;而在親和組合中（TcLr10接種葉銹菌小種260）該基因的表達在此時間區(qū)段雖也呈遞增趨勢，但其表達量遠遠低于不親和組合，說明在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中TaCRK2基因參與了基礎防衛(wèi)反應的誘發(fā)，且在其中發(fā)揮正調(diào)控作用。在接種16h之后，TaCRK2基因在三個不親和組合中的表達趨勢不同，在TcLr1和TcLr21形成的組合中仍有較高水平的表達，說明該基因有可能也介導了抗葉銹基因Lr1或Lr21誘發(fā)的防衛(wèi)反應，即HR-PCD過程;但在Tc