魚腥草SSR引物的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、魚腥草(Houttuynia cordata Thunb)是三百草科蕺菜屬多年生草本植物，在我國分布較廣，其不同地理居群在農(nóng)藝學(xué)性狀、藥用成分（如黃酮、揮發(fā)油等）及含量上都有較明顯的差異。SSR標記是一種短串聯(lián)重復(fù)序列分子標記，具有遺傳多樣性高、信息量豐富且呈現(xiàn)共顯性等特點。本研究首次應(yīng)用魚腥草的EST信息，建立魚腥草EST-SSR標記，并篩選與利用部分標記對魚腥草不同地理居群遺傳多樣性進行初步分析。具體研究結(jié)果如下:
　　 (

2、1)分析魚腥草EST中SSR的發(fā)生頻率及分布特性。利用魚腥草EST，進行SSR篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSR序列3487個（1313個SNPs除外），其中二核苷酸重復(fù)序列有1278個，三核苷酸重復(fù)序列為1994個，分別占全部SSR序列的36.65％和57.18％，而其余類型的重復(fù)序列只占全部序列的6.17％;對魚腥草EST-SSR進行特性分析，發(fā)現(xiàn)魚腥草二核苷酸重復(fù)以AG/CT為主，占全部二核苷酸重復(fù)序列的86.70％，三核苷酸重復(fù)以GAA/CT

3、T為最多，占全部三核苷酸重復(fù)序列的16.85％，說明魚腥草SSR具有明顯的偏倚性。分析魚腥草SSR長度，發(fā)現(xiàn)長度在20bp以上的有749條，在12-20bp之間的有2189條，表明魚腥草EST-SSR的多態(tài)信息含量較高。
　　 (2)建立魚腥草EST-SSRs標記并對其引物的PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化。以峨眉蕺菜DNA為材料，對魚腥草EST-SSR的PCR體系進行探索，結(jié)果表明:較佳的PCR反應(yīng)的體系為20μL，其中各試劑用量為14

4、.4μL ddH2(0)、2μL10×buffer、1.2μL MgCl2、0.5μL dNTP、上游引物、下游引物各0.35μL、Taq酶0.2μL、25ng/μL的模板1μL。PCR條件為94℃5min;94℃30s;56-58℃45s;72℃45s;72℃10min。利用50對EST-SSR引物進行PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28對能夠擴增出清晰明亮的條帶，利用這28對引物進一步檢測江蘇如皋和福建廈門2個地理居群多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對引物

5、具有多態(tài)性。
　　 (3)分析不同來源地魚腥草遺傳多樣性。利用(2)篩選到的20對引物，對17份不同地理來源魚腥草DNA進行PCR擴增，共擴增出141條核酸條帶，每對引物平均擴增出7.05條帶。其中有73條具有多態(tài)性位點，其多態(tài)性率為51.7％。17份不同地理居群魚腥草的遺傳相似率在0.6667-0.8936之間，平均為0.7802，表現(xiàn)出高度遺傳多樣性。聚類分析表明，17份不同居群的魚腥草，被分成了兩大類，其一類是主要分布在我