魚腥草注射劑過敏反應(yīng)機制的實驗研究.pdf

1、魚腥草是一種應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,具有抗菌、提高機體免疫力、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等作用。魚腥草的注射劑臨床應(yīng)用廣泛,但不良反應(yīng)較為突出,報道最多的是過敏反應(yīng),包括過敏性休克等嚴重過敏反應(yīng),嚴重危害了患者的健康和生命,同時影響了其臨床應(yīng)用,因此探討該類藥物的過敏反應(yīng)機制已成為迫切的研究課題。魚腥草的注射劑主要包括魚腥草注射液和注射用新魚腥草素鈉,魚腥草注射液含48種成分,其中魚腥草素(Houttuynin,HOU)為其主要藥效成

2、分;注射用新魚腥草素鈉僅含單一成分新魚腥草素(Neohouttuynin,NEO)。兩種注射劑所致的過敏反應(yīng)的發(fā)生機制迄今尚無報道,一般認為可能與魚腥草素和新魚腥草素有關(guān)。因此,本實驗重點研究魚腥草素和新魚腥草素在魚腥草注射劑致過敏反應(yīng)中的作用及機制。小分子抗原通過與載體蛋白耦聯(lián)才能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),用小分子化學(xué)物質(zhì)封閉其與蛋白發(fā)生耦連反應(yīng)的基團可能防止過敏反應(yīng)的發(fā)生。因此,本實驗嘗試用小分子化學(xué)物質(zhì)封閉魚腥草素與蛋白發(fā)生耦連反

3、應(yīng)的羥基,檢測被封閉后產(chǎn)物的藥效,嘗試解決魚腥草注射劑的過敏反應(yīng)問題。本實驗建立了魚腥草素和新魚腥草素致豚鼠過敏反應(yīng)模型,并探討了過敏反應(yīng)的發(fā)生機制,以求為過敏反應(yīng)的防治提供有效措施。材料與方法1.魚腥草素和新魚腥草素全抗原的制備采用牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)作為載體蛋白,與魚腥草素和新魚腥草素耦連制備全抗原,采用紫外掃描鑒定合成的全抗原

4、。2.豚鼠過敏反應(yīng)模型的建立豚鼠40只,體重200g~250g,雌雄各半,隨機均分為魚腥草素組、新魚腥草素組、陰性對照組和陽性對照組。魚腥草素組和新魚腥草素組第1天分別腹腔注射HOU-BSA和NEO-BSA加等量弗氏佐劑,第3,5.天分別注射HOU-BSA和NEO-BSA致敏,于第23天耳緣靜脈注射HOU-HSA和NEO-HSA激發(fā);陰性對照組第1天腹腔注射BSA加等量弗氏佐劑,第3,5天注射BSA,于第23天耳緣靜脈注射HSA;陽性對

5、照組第1,3,5天注射卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏,于第23天耳緣靜脈注射OVA激發(fā)。觀察激發(fā)后過敏反應(yīng)癥狀,取發(fā)生過敏反應(yīng)致死豚鼠的肺、肝組織制作病理切片,顯微鏡下觀察。3.致敏豚鼠血清特異性IgE和IgG抗體豚鼠12只,隨機均分為魚腥草素組和新魚腥草素組,分別于第11、15、19、23、27、31、35天心臟采血,制備血清備用。采用PCA測定特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律,鑒定特異性抗體的類型;采用酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(Enzy

6、me-linked immunospecific assay,ELISA)檢測豚鼠血清中特異性IgG抗體。4.肥大細胞脫顆粒和離體回腸收縮實驗采用被動肥大細胞脫顆粒實驗觀察正常豚鼠腹腔肥大細胞(Peritoneal mast cell,PMC)與致敏血清共孵育并用抗原液激發(fā)后觀察PMC脫顆粒情況并計算脫顆粒率。采用離體回腸實驗觀察致敏豚鼠離體回腸被攻擊后收縮情況。5.魚腥草素化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造為消除魚腥草素的過敏原性,采用乙二胺封閉魚腥草素

7、引發(fā)過敏反應(yīng)的羥基,并用抗菌試驗測定封閉后產(chǎn)物的藥效學(xué)變化。6.魚腥草注射劑的抗菌效應(yīng)魚腥草注射液的臨床常用量為12.6μg·kg-1(以其中魚腥草素的含量表示),為注射用新魚腥草素鈉的6.3％。本實驗探討了兩者臨床用量相差較大的原因,以確定其臨床應(yīng)用的合理性。6.1體外抗菌效應(yīng)檢定菌:金黃色葡萄球菌(G070601-3),河南省藥品生物制品檢定所;培養(yǎng)基:培養(yǎng)基Ⅱ,按2005版藥典配制;方盤制法:將200ml培養(yǎng)基(含0.01%菌原液

8、)平鋪于大方盤,以不銹鋼打孔器打孔,加樣后于37℃培養(yǎng)18h,測定樣本抑菌圈直徑。6.2體內(nèi)抗菌效應(yīng)小鼠尾靜脈注射不同濃度金葡菌菌液,以剛能引起小鼠全部死亡的菌液量作為最小致死量(Minimal lethal dose MLD)菌液。小鼠尾靜脈注射MLD菌液制造小鼠感染模型,腹腔注射魚腥草素、注射用新魚腥草素鈉和魚腥草注射液進行治療,對照組注射等體積生理鹽水,觀察和統(tǒng)計給菌后7天內(nèi)各組動物死亡率,用Bliss法計算三種藥物的ED25。7

9、.統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件,對各項數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料兩組比較分別采用獨立樣本t檢驗、配對資料t檢驗、Spearman相關(guān)性檢驗,檢驗水準(zhǔn)a為0.05。結(jié)果1.魚腥草素及新魚腥草素全抗原的制備紫外掃描圖譜顯示,耦聯(lián)產(chǎn)物在280nm處特征性吸收峰明顯增強,提示魚腥草素、新魚腥草素分別與牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)耦聯(lián)成功。2.豚鼠過敏反應(yīng)模型的建立魚腥草素組和新魚腥草素組豚鼠激發(fā)后,部分動物迅速發(fā)生呼吸困

10、難、翻滾臥倒、小便失禁甚至死亡等休克癥狀,兩致敏組過敏反應(yīng)發(fā)生率分別為80%和90%,休克發(fā)生率分別為20%和50%,死亡率分別為20%和40%。肺組織HE染色顯示:兩致敏組肺組織淤血,肺水腫合并肺氣腫,肺泡壁破壞嚴重,同時伴有廣泛的炎細胞浸潤。肝組織HE染色顯示:兩致敏組肝組織水腫明顯,有部分肝細胞胞膜破裂,并伴有炎癥細胞浸潤。肝肺組織病理變化表明,發(fā)生過敏反應(yīng)致死的豚鼠均呈現(xiàn)典型的過敏性休克特征。3.致敏豚鼠血清特異性IgE和IgG

11、抗體采用PCA分別測定魚腥草素及新魚腥草素組致敏豚鼠血清抗體產(chǎn)生的規(guī)律性,兩組豚鼠均是第一次致敏后第15天開始檢測出抗體,第23天達到高峰,之后逐漸降低。經(jīng)獨立樣本t檢驗發(fā)現(xiàn),兩實驗組抗體效價與過敏反應(yīng)分級均呈顯著性相關(guān)(P<0.01)。用加熱滅活后的血清致敏24h后激發(fā)PCA反應(yīng)陽性,72h后激發(fā)PCA反應(yīng)陰性,而同時注入體內(nèi)的非滅活血清72h后激發(fā)PCA反應(yīng)陽性,說明兩致敏組豚鼠體內(nèi)同時存在IgE和IgG型特異性抗體。經(jīng)Spearm

12、an相關(guān)性分析,IgE和IgG抗體效價之間無相關(guān)性(P>0.05)。采用ELISA檢測了豚鼠血清特異性IgG抗體,魚腥草素組、新魚腥草素組和正常豚鼠分別為0.36±0.18、0.51±0.19和0.15±0.07。獨立樣本t檢驗結(jié)果表明,兩致敏組IgG抗體水平均高于正常對照組(P<0.05);經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,ELISA所測特異性IgG水平與PCA所測特異性IgG效價之間存在相關(guān)性(P<0.05)。4.肥大細胞脫顆粒和離體回

13、腸收縮實驗致敏血清原液處理并經(jīng)抗原攻擊后,有大量肥大細胞膜不完整,顆粒脫出胞外,陰性對照組、陽性對照組、魚腥草素組和新魚腥草素組的脫顆粒率分別為(29.2±6.61)、(70.4±12.5)%、(63.6±7.5)%和(70.8±13.6)%。經(jīng)獨立樣本t檢驗發(fā)現(xiàn),兩實驗組肥大細胞脫顆粒率均顯著高于陰性對照組(P<0.01),與陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。魚腥草素組與新魚腥草素組的致敏離體回腸經(jīng)抗原攻擊后,腸管收縮明顯增

14、強;若在攻擊前加入苯海拉明,則離體回腸無明顯收縮。5.魚腥草素化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造采用乙二胺封閉魚腥草素與血清蛋白發(fā)生反應(yīng)的羥基后測定封閉后產(chǎn)物的抗菌活性。結(jié)果顯示,封閉后的魚腥草素雖表現(xiàn)為一定的抗菌活性,但抗菌活性較反應(yīng)前明顯降低,說明采用該方法雖可能降低魚腥草素的過敏原性,但影響其藥效的發(fā)揮。6.魚腥草注射劑的抗菌效應(yīng)6.1體外抗菌效應(yīng)魚腥草素低濃度組(相當(dāng)于魚腥草注射液中魚腥草素的濃度)與魚腥草素注射液組均未出現(xiàn)抗菌效應(yīng),而魚腥草素高濃

15、度組(相當(dāng)于魚腥草注射液中魚腥草素濃度的4倍)出現(xiàn)抗菌效應(yīng),說明魚腥草注射液中魚腥草素的含量較低,體外抗菌活性較差。6.2體內(nèi)抗菌效應(yīng)魚腥草素、注射用新魚腥草素鈉和魚腥草注射液的ED25分別為4.58、4.29和0.56 mg·kg-1。結(jié)果顯示,在達到同樣藥效(保護25%的敗血癥小鼠存活)時,魚腥草注射液的用量僅為魚腥草素和注射用新魚腥草用量的12.2%和13.1%。體外和體內(nèi)抗菌實驗結(jié)果提示:魚腥草注射液中除魚腥草素外的其它成分在體