基于魚腥草抗炎活性的質(zhì)量評價及其作用機(jī)制研究.pdf

1、魚腥草為三白草科蕺菜（Houttuynia cordata Thunb.）的新鮮全草，作為傳統(tǒng)的清熱解毒中藥，因其藥食同源，具有廣泛的學(xué)術(shù)研究價值。在魚腥草眾多化學(xué)成分中，以揮發(fā)油成分的藥用活性價值最高，主要含癸酰乙醛（又名“魚腥草素”）、甲基正壬酮等脂肪族成分和α-蒎烯、β-月桂烯等萜類成分。本院結(jié)合地方藥材資源特色，以魚腥草水蒸氣蒸餾液制成的魚腥草滴鼻劑（醫(yī)院制劑），用于治療急慢性鼻炎、鼻竇炎療效確切，臨床生產(chǎn)應(yīng)用已有近40年歷史。

2、在此基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)行了魚腥草鼻噴劑的開發(fā)研究。近期的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚腥草鼻用噴霧劑對急、慢性鼻炎的臨床療效均顯著優(yōu)于生理鹽水安慰劑組。
　　中藥及其制劑藥效成分復(fù)雜，以多層次、多靶點(diǎn)作用于機(jī)體生物網(wǎng)絡(luò)中某些特定環(huán)節(jié)而發(fā)揮其整體效應(yīng)。為真正反映中藥的內(nèi)在、整體質(zhì)量，保障中藥制劑的臨床有效性和安全性，基于生物活性的質(zhì)量評價模式的建立將成為中藥及其制劑質(zhì)量研究的趨勢。為探討基于魚腥草抗炎活性共有成分的質(zhì)量評價模式，本論文首先選

3、擇來源于不同產(chǎn)地魚腥草中的四種共有揮發(fā)性成分（α-蒎烯、β-月桂烯、癸醇和甲基正壬酮），分別考察了其體內(nèi)抗炎藥效的量效關(guān)系；在量效關(guān)系成正比的基礎(chǔ)上，建立了氣相色譜法同時測定四種共有成分含量的方法；體內(nèi)化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜定性分析結(jié)果顯示，四種共有成分均以其原型進(jìn)入體內(nèi)；進(jìn)而對不同含量共有成分的魚腥草樣品與其體內(nèi)抗炎藥效的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其體外含量與體內(nèi)抗炎藥效亦呈正相關(guān)。
　　除上述抗炎活性共有成分外，癸酰乙醛的亞硫酸氫

4、鈉加成物魚腥草素鈉也是魚腥草的重要活性成分，以魚腥草素鈉為原料的制劑已用于臨床多年。由于癸酰乙醛在水蒸氣蒸餾過程中受熱易被轉(zhuǎn)化成甲基正壬酮，魚腥草素鈉也可能存在相同的轉(zhuǎn)化過程。為保障魚腥草素鈉在制劑工藝中的穩(wěn)定性，探討其發(fā)揮抗炎藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型和二甲苯所致小鼠耳腫脹模型對魚腥草素鈉與甲基正壬酮的體內(nèi)外抗炎藥效進(jìn)行比較。結(jié)果表明，魚腥草素鈉在同等劑量下的體內(nèi)外抗炎活性均優(yōu)于甲基正壬酮。隨后對魚腥

5、草素鈉向甲基正壬酮轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在體外影響魚腥草素鈉轉(zhuǎn)化的主要因素是溶劑、溫度和pH值。而在體內(nèi)，魚腥草素鈉未轉(zhuǎn)化成甲基正壬酮，以其原型迅速進(jìn)入血液循環(huán)并分布到各組織中。
　　鑒于魚腥草素鈉的體內(nèi)外抗炎活性優(yōu)于甲基正壬酮，而魚腥草素鈉與癸酰乙醛具有相同的藥理活性，既往僅以甲基正壬酮為評價指標(biāo)的魚腥草藥材及其制劑的質(zhì)量評價，顯然不能真實(shí)反映其整體質(zhì)量。為優(yōu)選魚腥草原料，從而為保障魚腥草制劑的質(zhì)量均一性和臨床有效性提供參

6、考，本文分別于全年不同月份采收新鮮魚腥草，以乙酸乙酯回流提取制備供試品溶液，以癸酰乙醛為代表的多個含量較高的共有成分為評價指標(biāo)，研究魚腥草不同植物部位在不同采收季節(jié)的成分類別及其含量的差異性；同時考察了其在晾干、曬干和冷凍干燥等不同干燥方式下代表性成分含量的差異性；運(yùn)用聚類分析技術(shù)結(jié)合色譜分析結(jié)果進(jìn)行綜合評價。結(jié)果表明，新鮮藥材的不同植物部位有其相應(yīng)的較佳采收季節(jié)；以癸酰乙醛為主的各成分的含量與干燥程度成反比，在相同的干燥程度下，冷凍干

7、燥比晾干、曬干能保留相對較多的癸酰乙醛。
　　在基于抗炎活性成分的質(zhì)量評價與體內(nèi)外藥效研究的基礎(chǔ)之上，為探討魚腥草揮發(fā)油及其活性單體成分發(fā)揮抗炎作用靶點(diǎn)的差異性，從而為它們體內(nèi)抗炎藥效的強(qiáng)弱提供理論依據(jù)，本文選擇TLR4/MD-2阻斷劑封閉TLR4/MD-2位點(diǎn)，運(yùn)用western blot法檢測魚腥草揮發(fā)油、魚腥草素鈉和甲基正壬酮干預(yù)后的細(xì)胞中TLR4蛋白和MAPK通路中JNK蛋白的表達(dá)水平；運(yùn)用 Elisa法對它們干預(yù)后的細(xì)胞

8、中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的分泌水平進(jìn)行檢測；同時，對體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)抗炎藥效試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，魚腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮通過部分阻斷TLR4/MD-2靶點(diǎn)抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4和JNK表達(dá)以及細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮其抗炎作用；在同等劑量下，魚腥草素鈉對JNK和細(xì)胞因子的影響均強(qiáng)于魚腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮，可能通過除 TLR4/MD-2靶點(diǎn)外的其他途徑發(fā)揮其抗炎作用，從而表現(xiàn)出其體內(nèi)外與魚腥草揮