海藻酸微囊在鼠胚成纖維細(xì)胞及綿羊精原干細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用.pdf

1、精原細(xì)胞是雄性成體體內(nèi)唯一能將遺傳信息完整傳遞給后代的二倍體細(xì)胞。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞研究領(lǐng)域逐漸形成一個(gè)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)想結(jié)合的研究領(lǐng)域，其目的是將干細(xì)胞潛能應(yīng)用到實(shí)踐中，為醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究提供一個(gè)研究方向和平臺(tái)。但是精原干細(xì)胞冷凍保存效率低下嚴(yán)重限制了相關(guān)研究的進(jìn)行，鑒于此，很多研究者開始從不同角度出發(fā)去尋求一個(gè)高效的冷凍保存方案。本研究立足新型生物材料的引入，在體外環(huán)境下構(gòu)建一個(gè)微環(huán)境，直接對(duì)微環(huán)境下的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存操作，以

2、期能提高細(xì)胞尤其是精原干細(xì)胞的冷凍保存效率。
　　1.海藻酸微囊的制作方法
　　海藻酸微囊是利用海藻酸鹽溶液遇到多種二價(jià)陽(yáng)離子能交聯(lián)生成凝膠這一特性生成的。生成海藻酸微囊的方法包括高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作法、毛細(xì)管破碎制作法、氣體吹噴制作法等，本文綜合各個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。鑒于高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作法具有操作方便、效率高、生成微囊大小均勻等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作海藻酸微囊。生成了大小均一，形態(tài)完整，直徑在

3、300μm左右的海藻酸-Ca2+微囊，所得微囊能用于細(xì)胞的包埋和進(jìn)一步的相關(guān)研究。
　　2.海藻酸微囊替代DMSO和FBS的STO細(xì)胞冷凍保存研究
　　目的:改進(jìn)現(xiàn)有的細(xì)胞冷凍保存方法，建立一個(gè)不含二甲基亞砜(DMSO)和血清(FBS)的高效冷凍保存方法，為細(xì)胞治療等臨床實(shí)踐提供優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。方法:設(shè)五個(gè)實(shí)驗(yàn)組:藻酸微囊包埋STO細(xì)胞不含DMSO和FBS的冷凍保存（微囊D-F-）、添加10％DMSO和20％FBS的組(D+F+)

4、、僅添加10％DMSO的組(D+F-)、僅添加20％FBS(D-F+)、DMSO和FBS均不添加組(D-F-)。在冷凍前后對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用臺(tái)盼蘭染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)利用溴乙錠的二聚物(EthD)、鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）進(jìn)行染色觀察細(xì)胞的形態(tài)，且進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞存活率;解凍復(fù)蘇后用MTT法評(píng)估細(xì)胞的增殖速度和生長(zhǎng)活力。結(jié)果:冷凍保存30d后對(duì)各組的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)和解凍復(fù)蘇后細(xì)胞的生長(zhǎng)活力進(jìn)

5、行比較發(fā)現(xiàn)，海藻酸微囊包埋冷凍組的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)活力均與添加DMSO和FBS的組之間無顯著性差異，而與其它三個(gè)對(duì)照組呈顯著性差異。結(jié)論:使用海藻酸微囊替代DMSO和FBS保存STO細(xì)胞，能有效的維持細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、存活率，同時(shí)不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，從而建立了一個(gè)不含DMSO和FBS的高效冷凍保存方法。
　　3.用海藻酸微囊法冷凍保存綿羊精原干細(xì)胞
　　細(xì)胞冷凍保存技術(shù)是動(dòng)物研究的重要組成部分。本研究首次應(yīng)

6、用海藻酸微囊冷凍保存綿羊精原干細(xì)胞(SSCs)，旨在提高綿羊SSCs的冷凍保存效率。在綿羊SSCs液氮凍存1d后對(duì)綿羊SSCs進(jìn)行存活率評(píng)估、細(xì)胞生長(zhǎng)增值能力比較和CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1五個(gè)精原干細(xì)胞特異分子標(biāo)記基因的免疫熒光鑒定。結(jié)果表明，在液氮凍存1d后，單細(xì)胞懸液凍存組綿羊SSCs活率為58.4％±1.4％，海藻酸微囊包埋凍存組為78.7％±1.3％，同時(shí)海藻酸微囊包埋凍存組細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)增值能力明顯

7、好于單細(xì)胞懸液凍存組，解凍培養(yǎng)四d，海藻酸微囊組細(xì)胞數(shù)為2.1×105cells/孔，顯著高于單細(xì)胞懸液凍存組(1.1×105cells/孔)。解凍復(fù)蘇培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)在微囊包埋凍存1d后CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1均顯示陽(yáng)性。在液氮凍存10d后，海藻酸微囊組綿羊SSCs存活率仍然維持在78.0％±1.5％，與液氮凍存1d時(shí)細(xì)胞存活率（78.7％±1.3％）和凍存前細(xì)胞存活率（82.2％±1.9

8、％）相比沒有顯著下降，而在單細(xì)胞懸液凍存組中，細(xì)胞存活率從82.2％土1.9％一直下降到液氮凍存1d的58.4％±1.4％和液氮凍存10d的48.1％±0.8％。也就是說海藻酸微囊包埋綿羊SSCs細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，細(xì)胞的存活率不會(huì)隨著液氮凍存時(shí)間的增加而顯著下降，同時(shí)凍存10d后綿羊SSCs仍然保持著快速恢復(fù)生長(zhǎng)增值能力，表達(dá)綿羊SSCs的特異標(biāo)記基因。綜上所述，海藻酸微囊的應(yīng)用顯著提高了綿羊SSCs的冷凍保存效率，且對(duì)綿羊SSCs的標(biāo)