新城疫病毒M蛋白功能結構域突變以及M蛋白與細胞核磷蛋白B23互作影響病毒復制的分子機制.pdf

1、ThemolecularmechanismoftheeffectsoffunctionaldomainsmutationintheMproteinandtheinteractionofMproteinwithcellularnucleolarphosphoproteinB23onthereplicationofNewcastlediseasevirusADissertationSubmittedinPartialFulfillmento

2、ftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophy1nPreventiveVeterinaryMedicineCollegeofVeterinaryMedicineYangzhouUniversityYangzhou，PRChinaPhDcandidate：ZhiqiangDuanAdvisor：ProfXiufanLiuMay2014II揚州大學博士學位論文白NES中關鍵疏水性氨基酸的鑒定

3、結果表明，3個NES的最后2個疏水性氨基酸在NES介導的核輸出能力中起關鍵作用，而且這些關鍵氨基酸在不同基因型NDVM蛋白中均保守。此外，將M蛋白NES進行單個或聯(lián)合突變，發(fā)現(xiàn)單個或2個NES聯(lián)合突變不影響M蛋白細胞質定位，而3個NES聯(lián)合突變則導致M蛋白由細胞質定位變?yōu)榧毎硕ㄎ?。在此過程中，使用出核轉運抑制劑LeptomycinB均不影響NES突變前后M蛋白亞細胞定位。我們的結果說明，NDVM蛋白中存在3個NES共同決定M蛋白的細胞

4、質定位，而且3個NES介導的M蛋白核輸出途徑是CRMl非依賴的。2新城疫病毒M蛋白FPIV晚期結構域突變影響病毒的復制和出芽本研究根據(jù)其它副黏病毒M蛋白中已報道的晚期結構域，將NDVZJl株M蛋白氨基酸序列與之進行比對分析，發(fā)現(xiàn)NDVM蛋白中存在與人副流感病毒5型和腮腺炎病毒M蛋白相似的FPIV晚期結構域。以NDVZJl株全長cDNA克隆質粒pNDV／ZJl為骨架構建M蛋白點突變全長質粒，利用反向遺傳學技術，我們成功拯救出FPIV點突變

5、的四株病毒。病毒在雞胚和細胞中的復制能力測定結果顯示，四株突變病毒能在雞胚中穩(wěn)定繁殖，但F或P突變的病毒在雞胚和細胞中的復制能力顯著下降。同時，病毒生物學特性測定結果表明，F(xiàn)或P突變導致病毒的MDT(分別為102h和84h)與親本病毒(54h)相比明顯延長，并且ICPI測定值(分別為164和170)與親本病毒(189)相比也明顯下降，說明F或P突變能降低病毒的復制能力和致病性。此外，病毒出芽效率測定結果顯示，F(xiàn)或P突變導致病毒在DF1細

6、胞中的出芽效率顯著降低，而且影響M蛋白與病毒出芽相關細胞蛋白VPS4A的結合。我們的結果說明，NDVM蛋白中的FPIV基序是病毒出芽必需的晚期結構域，而FPIV晚期結構域中的氨基酸F和P對病毒復制、致病力以及出芽過程起關鍵作用。同時，NDV的出芽過程需要依賴宿主細胞內多泡體蛋白分選途徑。3新城疫病毒M蛋白R42A突變影響M蛋白細胞核定位并且降低病毒的復制和致病性NDVM蛋白是一種具有高度堿性、疏水性但不跨膜的病毒蛋白。對M蛋白電荷分布分

7、析發(fā)現(xiàn)，M蛋白N端前100位氨基酸總體呈酸性，僅含有個別堿性氨基酸。本研究對NDVZJl株M蛋白N端前100位氨基酸中的堿性氨基酸進行突變，以觀察點突變對M蛋白亞細胞定位的影響，并通過反向遺傳學技術拯救點突變病毒，進一步研究突變對病毒復制和致病性的影響。結果顯示，M蛋白第42位堿性氨基酸R突變?yōu)锳后，導致M蛋白由細胞核和核仁定位變?yōu)榧毎|定位，但是不影響M蛋白與病毒NP蛋白和FIN蛋白的相互作用。將NDV與其它副黏病毒M蛋白氨基酸序列進