新城疫病毒M蛋白功能性氨基酸突變和M蛋白與膜聯(lián)蛋白A6互作影響病毒復(fù)制分子機(jī)制.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是副黏病毒科（Par amyxo viridae），禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的一個(gè)成員，為具有囊膜且含單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA基因組的病毒，其基因組大小約為15.1kb，至少編碼6種病毒蛋白。其中，M蛋白是含量最為豐富且高度保守的非糖基化膜相關(guān)蛋白，主要位于病毒囊膜內(nèi)表面，構(gòu)成病毒內(nèi)膜與核衣殼蛋白連接的支架。同其它副黏病毒M蛋白一樣，NDVM蛋白也具有細(xì)胞核

2、-細(xì)胞質(zhì)穿梭特性。在病毒感染早期，M蛋白主要聚集在細(xì)胞核和核仁中，并且在整個(gè)感染過程中持續(xù)存在于核仁中，其主要功能是抑制宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并確保病毒基因組在細(xì)胞質(zhì)中有充足的時(shí)間進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;而在感染后期，M蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)能夠通過與糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)、病毒核衣殼蛋白以及宿主細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，以協(xié)助子代病毒粒子進(jìn)行裝配和釋放。因此，M蛋白是一種多功能病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制的過程中，尤其是在病毒的組裝和出芽釋放階段發(fā)揮

3、著核心的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的前期工作，已經(jīng)確定了M蛋白對新城疫病毒的復(fù)制及致病性存在重要的影響。然而目前為止，對M蛋白在NDV復(fù)制過程中的作用還有諸多未知的地方。本研究旨在探索M蛋白功能性氨基酸位點(diǎn)突變以及M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用影響病毒復(fù)制的分子機(jī)制為研究目的，為進(jìn)一步闡明M蛋白在NDV復(fù)制中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　1.鴿副粘病毒1型M蛋白R36Q突變致弱病毒毒力及復(fù)制能力
　　鴿副粘病毒1型(PPMV-1)是一種能夠特異

4、性的感染宿主鴿子的病原體，通常被認(rèn)為是禽副粘病毒1型(APMV-1)在鴿子上的適應(yīng)性變種。有研究報(bào)道PPMV-1的這種適應(yīng)性變化與病毒基因及蛋白的變化有關(guān)，但是到目前為止，這種變化與病毒的生物學(xué)特性的關(guān)系仍未見報(bào)道。M蛋白通常被認(rèn)為是僅次于F和HN蛋白的毒力因子，而M蛋白在病毒感染的早期過程中發(fā)揮著重要作用。有報(bào)道M蛋白對于PPMV-1的遺傳進(jìn)化及宿主適應(yīng)性可能有重要作用。本研究首先對145株新城疫毒株（39株P(guān)PMV-1，106株AP

5、MV-1）進(jìn)行了氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)特異性氨基酸位點(diǎn)分別位于M，F(xiàn)，HN及L蛋白上，其中R36是位于M蛋白上的特異性氨基酸位點(diǎn)，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)R36位點(diǎn)是M蛋白上的正向選擇位點(diǎn);隨后我們以PPMV-1 Js/07/04/Pi(071204)株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/071204為骨架構(gòu)建了M蛋白R36Q突變的重組病毒r071204-M.R36Q，為了進(jìn)行反向比較，同時(shí)構(gòu)建了以表達(dá)綠色熒光蛋白的NDV ZJ1株全長cDNA

6、克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構(gòu)建了M蛋白Q36R突變的重組病毒rZJ1GFP-M.Q36R。對兩株重組病毒及其母本病毒進(jìn)行生物學(xué)特性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R36Q突變能夠致弱r071204在細(xì)胞和雞胚上的毒力并降低病毒復(fù)制能力，而Q36R突變對于rZJ1GFP母本病毒的各項(xiàng)生物學(xué)特性的影響沒有顯著差異。另外，鴿子攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，R36Q突變使得r071204-M.R36Q重組病毒在排毒時(shí)間及排毒量上都要顯著低于母本病毒r071204

7、。以上結(jié)果說明PPMV-1 M蛋白的R36可能是病毒宿主適應(yīng)性的一個(gè)關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)，對PPMV-1的復(fù)制能力、致病性及傳播具有至關(guān)重要的作用。
　　2.新城疫病毒M蛋白G275A和P276A聯(lián)合突變影響病毒的復(fù)制和出芽
　　據(jù)報(bào)道，M蛋白在病毒感染后期在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)進(jìn)行病毒粒子的組裝和出芽依賴于M蛋白C-端由2個(gè)α-螺旋包裹2個(gè)反向平行的β-折疊形成的特異性折疊結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞膜結(jié)合,后續(xù)研究推測，NDV M蛋白的275位G與

8、鄰近的276位P形成的GP組合對M蛋白形成正確的β-折疊極為重要。本研究中，我們首先對過去的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，通過將NDVM蛋白序列與其他副黏病毒M蛋白序列進(jìn)行氨基酸比對，并結(jié)合三維結(jié)構(gòu)模擬分析，我們證實(shí)NDV M蛋白C-端的LGP序列能夠發(fā)揮類似雙重氨基酸G的作用，當(dāng)GP突變?yōu)锳A時(shí)，M蛋白的折疊發(fā)生了角度的變化，影響了M蛋白功能的發(fā)揮，繼而，我們拯救了兩株突變重組病毒，分別是rZJ1GFP-M.LGP/GGL，rZJ1GFP-M.

9、GP/AA，生物學(xué)特性測定的結(jié)果顯示，GP/AA突變重組病毒顯著降低了病毒在雞胚及細(xì)胞上的復(fù)制能力和致病性，動物致病性實(shí)驗(yàn)也說明GP/AA突變造成了病毒的致弱，以上結(jié)果均說明GP序列對于病毒復(fù)制及致病性是至關(guān)重要的，此外，對重組病毒在細(xì)胞上的出芽能力進(jìn)行測定，結(jié)果表明GP/AA突變后能夠大幅損傷病毒出芽能力，間接說明GP/AA突變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化影響了病毒粒子的出芽，這也解釋了為何病毒的復(fù)制能力下降。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明M蛋白上的GP序列在

10、NDV的生活周期中發(fā)揮了極為重要的作用。然而，仍需進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)來闡釋GP影響出芽的具體機(jī)制。
　　3.新城疫病毒M蛋白羧基端功能結(jié)構(gòu)域影響病毒的早期復(fù)制
　　本研究對NDV ZJ1株M蛋白C-端影響二聚體矩陣形成的氨基酸進(jìn)行突變，并觀察點(diǎn)突變對M蛋白亞細(xì)胞定位的影響，然后通過反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救點(diǎn)突變病毒，進(jìn)一步研究點(diǎn)突變對病毒復(fù)制和致病性的影響。結(jié)果顯示，M蛋白C-端D255、E258、R262、R263氨基酸單

11、點(diǎn)突變以及255/258(DE)雙點(diǎn)突變后，不影響M蛋白細(xì)胞核和核仁定位，但是262/263(RR)、255/263、258/262雙突變后導(dǎo)致M蛋白由細(xì)胞核及核仁定位變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)定位，隨后我們以表達(dá)綠色熒光蛋白的NDV ZJ1株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構(gòu)建了M蛋白相應(yīng)的單點(diǎn)突變及雙點(diǎn)突變?nèi)L質(zhì)粒pNDV/ZJ1 GFP-Mwt，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，成功拯救出8株重組病毒。生物學(xué)特性測定結(jié)果顯示，單點(diǎn)及雙點(diǎn)突變均不

12、能導(dǎo)致病毒的生物學(xué)特性發(fā)生改變。然而，255/258(DE)、262/263(RR)、255/263、258/262雙突變病毒在DF1細(xì)胞中早期的增殖能力、CPE形成能力及表達(dá)GFP能力均顯著下降，說明雙突變僅僅降低了病毒的早期復(fù)制能力和致病性。我們的研究結(jié)果表明影響M蛋白二聚體矩陣形成的氨基酸位點(diǎn)能夠影響M蛋白的細(xì)胞核定位，并且降低病毒的早期復(fù)制能力和致病性。
　　4.新城疫病毒M蛋白與細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A6相互作用影響病毒的復(fù)制

13、r>　　由于病毒編碼蛋白能力的限制，病毒不能編碼出復(fù)制所需的所有蛋白，因此，病毒往往需要利用宿主細(xì)胞蛋白或細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分來完成病毒的復(fù)制過程。本研究中我們首先通過激光共聚焦對M蛋白與宿主膜聯(lián)蛋白A6(ANXA6)蛋白在細(xì)胞中的定位情況進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示M蛋白與ANXA6蛋白在細(xì)胞質(zhì)中存在著共定位。此后，通過免疫共沉淀技術(shù)和GST Pull-down實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了M蛋白與ANXA6蛋白能夠發(fā)生互作。通過HisPull-down方法

14、對M蛋白與ANXA6相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)M蛋白aa250-280是M蛋白與ANXA6蛋白結(jié)合的區(qū)域。為了探索ANXA6蛋白與M蛋白互作對病毒復(fù)制的影響，我們設(shè)計(jì)了RNA干擾實(shí)驗(yàn)以及宿主細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ANXA6實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，抑制ANXA6蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)病毒感染細(xì)胞病變的產(chǎn)生并提高了病毒的復(fù)制效率，說明ANXA6的存在抑制了病毒的復(fù)制;另一方面，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ANXA6蛋白顯著減輕了NDV感染細(xì)胞引起的CPE并抑制了病毒的增殖，說明